Nel processo di coltura cellulare, spesso è richiesta la digestione cellulare, quindi la tripsina utilizzata per digerire le cellule sarà indispensabile per la coltura cellulare e sarà anche molto importante, poiché influenzerà lo stato di crescita delle cellule.
La tripsina può essere sostanzialmente divisa in due tipi: la tripsina ricombinante e la tripsina non ricombinante.
- La tripsina non ricombinante è derivata da estrazione animale, di origine animale, ed è anche l'uso tradizionale della tripsina, che si trova comunemente nell'apparato digerente degli animali ed è estratta direttamente dal tessuto pancreatico di bovini o suini.
- La tripsina ricombinante viene prodotta utilizzando la tecnologia genetica ricombinante e non è di origine animale.
Introduzione e applicazione del prodotto
Tripsina non ricombinante (derivata da animali)
Caratteristiche del prodotto:La tripsina non ricombinante (nota anche come tripsina) è un enzima proteolitico della serina estratto dal pancreas di bovini, ovini e suini, in grado di scindere specificamente il terminale carbossilico della lisina e dell'arginina caricate positivamente, purificato mediante cristallizzazione multipla e ulteriormente preparato mediante cromatografia e tecnologia di ultrafiltrazione, di origine animale.
Poiché gli enzimi pancreatici possono agire sulle proteine transmembrana e sulle proteine nella matrice extracellulare, come caderina, integrina, ecc., ora sono comunemente usati per dissociare tessuti e cellule monostrato. Sebbene la tripsina possa idrolizzare la proteolisi tra cellule in cellule discrete, la reazione di tessuti o cellule diversi alla tripsina è diversa e l'attività delle cellule disperse è anche correlata alla concentrazione di tripsina, alla temperatura e al tempo di reazione e la capacità della tripsina di disperdere le cellule è più forte in condizioni di pH di 7-9 e temperatura di 37 °C. L'aggiunta di EDTA alla soluzione di tripsina come agente chelante lega calcio e magnesio in una struttura a sei denti, che può indebolire l'adesione cellula-cellula e migliorare l'acquisizione da parte della tripsina di legami peptidici mirati idrolizzati.
L'applicazione principale della tripsina nei primi giorni nel campo biofarmaceutico era la produzione di insulina, e presto è stata utilizzata anche in altri campi di coltura cellulare. Gli enzimi pancreatici animali sono comunemente utilizzati nella coltura del siero, e la composizione e la concentrazione di tripsina aggiunta a cellule diverse sono diverse.
Applicazioni- produzione di insulina e vaccini inattivati;
- Isolamento e coltura delle cellule tissutali;
- Uso clinico e chirurgico;
- Coadiuvanti tecnologici nell'industria alimentare;
Tripsina ricombinante (senza origine animale)
Caratteristiche del prodotto
La tripsina ricombinante è un enzima prodotto utilizzando la tecnologia di ingegneria genetica, che ha i vantaggi di una buona stabilità, elevata purezza e nessuna origine animale. Nel processo di produzione dei moderni biofarmaci, l'uso di materie prime contenenti origine animale può portare potenziali fonti di virus che causano malattie zoonotiche nel prodotto, come BSE della mucca pazza, virus della febbre aftosa, ecc., al fine di ridurre la fonte di inquinamento, la tripsina viene sintetizzata tramite la tecnologia di ingegneria genetica, che risolve il rischio di contaminazione da virus che può essere portato dalla tripsina tradizionale suina o bovina.
La tripsina ricombinante è per lo più espressa in modo ricombinante da E. coli ricombinante o sistema di lievito e purificata tramite cromatografia multi-step, senza contaminazione da eterozima come la chimotripsina. La tripsina ricombinante ha le stesse proprietà della tripsina estratta naturalmente, con una sequenza di amminoacidi omologa alla sequenza della tripsina suina, che scinde specificamente i gruppi carbossilici nei residui di lisina e arginina nella catena polipeptidica.Grazie al suo elevato grado di purezza e al suo inquinamento di origine non animale, trova un'ampia applicazione nello sviluppo farmaceutico, nella ricerca biochimica, nella proteomica e in altri campi.
La tripsina ricombinante più diffusa sul mercato è una tripsina suina ricombinante espressa in Escherichia coli o lievito utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante, e la sua sequenza di amminoacidi è completamente coerente con la tripsina suina, con la stessa attività e specificità della tripsina naturale. È composta da 223 amminoacidi e contiene 6 coppie di legami disolfuro. L'enzima contiene due forme attive di tripsina: α-tripsina e β-tripsina. La sua attività è inibita da inibitori della serina proteasi come PMSF e TLCK, chelanti di ioni metallici come EDTA, ecc. La tripsina ricombinante è utilizzata in colture prive di siero e, come la tripsina, a cellule diverse vengono aggiunti diversi componenti e concentrazioni di tripsina.
Applicazioni- produzione di vaccini e insulina ricombinante;
- Preparazione di campioni di tessuto per l'analisi cellulare;
- Terapia con cellule immunitarie;
- Produzione biofarmaceutica;
- Ricerca sulla sequenza proteica, sulla struttura e sulle omiche
Confronto dettagliato dei prodotti
| prodotti | Tripsina non ricombinante (derivata da animali) | Tripsina ricombinante (senza origine animale) |
| Articolo | 40123ES (rosso fenolo (-), EDTA (+)) 40124ES (rosso fenolo (-), EDTA (-)) 40126ES (rosso fenolo (+), EDTA (-)) 40127ES (rosso fenolo (+), EDTA (+)) | 40512ES 20416ES (MS-SAFE) |
| Fonte | Prelevato dal pancreas di bovini, suini e ovini | colibacillo（40512ES） Pichia pastoris（20416ES） |
| Sicurezza | Contaminazione con potenziali agenti patogeni | Nessuna contaminazione virale esogena |
| Purezza | Oltre il 90% della soluzione di tripsina 1:250 è impurità | Elevata purezza (β-tripsina ≥ 70%, α-tripsina≤20%） |
| Tipo di cellula digestiva | La maggior parte delle linee cellulari fortemente aderenti contigue | La maggior parte delle linee cellulari fortemente aderenti contigue |
| Limite della chimotripsina | Non più di 50 unità di chimotripsina per 2500 unità di tripsina. | Nessuna contaminazione da mirosinasi e altri enzimi di impurità |
| Attività specifica | ≥2500 Unità USP/mg di proteine | ≥3800 Unità USP/mg di proteine |
| Effetto digestivo | instabilità | Digestione forte e bassa quantità di enzimi |
| Tasso di auto-taglio | È facile autotagliarsi e produrre frammenti autotaglianti, il che influisce sui risultati dell'analisi della spettrometria di massa | È facile autotagliarsi e produrre frammenti autotaglianti, il che influisce sui risultati dell'analisi della spettrometria di massa |
| Liquido disciolto | Soluzione HBSS con o senza Ca2+, Mg2+ | Soluzione HBSS con o senza Ca2+ e Mg2+ (40512ES); 1 mM HCL（20416ES） |
| Sopravvivenza cellulare | Normale | Normale |
| Se è necessario il congelamento-scongelamento | SÌ | SÌ |
Oltre alla tripsina, la più comune, utilizzata nella digestione cellulare, esistono molti altri tipi di prodotti enzimatici digestivi che possono essere utilizzati, come ad esempio:
Informazioni sul campo di applicazione della collagenasiLa collagenasi è una peptidasi endonucleasi in grado di riconoscere specificamente la sequenza Pro-X-Gly-Pro e di scindere il legame peptidico tra l'amminoacido neutro (X) e la glicina (Gly) nella sequenza; la collagenasi è l'unica proteasi in grado di degradare le fibrille di collagene naturale con una struttura superavvolta a tre filamenti e può idrolizzare efficacemente altre proteine, polisaccaridi e lipidi nella matrice extracellulare del tessuto connettivo e del tessuto epiteliale, rendendo questo prodotto molto adatto per la digestione dei tessuti.
- Collagenasi I., comunemente utilizzata come preparazione di cellule epiteliali, cellule del fegato, dei polmoni, del grasso e del tessuto surrenale;
- Collagenasi II, utilizzata per la preparazione di cellule derivate da tessuti quali cuore, ossa, muscoli, fegato, tiroide e cartilagine;
- Collagenasi III, comunemente utilizzata nella preparazione delle cellule mammarie;
- Collagenasi IV, comunemente utilizzata per la preparazione di cellule di isole pancreatiche o per esperimenti di preparazione cellulare in cui è necessario mantenere l'integrità del recettore.
- Collagenasi V., adatta per l'isolamento delle cellule delle isole pancreatiche e delle cellule del tessuto connettivo.
Accutase è un digest cellulare che contiene attività proteolitica e collagenasi, ed è un sostituto perfetto per i digest tripsina-EDTA per la digestione di cellule da contenitori di coltura tissutale convenzionali e contenitori di coltura aderenti. Accutase è adatto per la dissociazione dei tessuti e l'isolamento cellulare, poiché le cellule isolate mantengono antigeni di superficie intatti e non contengono componenti di origine animale o batterica, il che può soddisfare i requisiti di esperimenti successivi come l'etichettatura della superficie cellulare, l'analisi della crescita virale, la citometria a flusso e i test correlati al bioreattore.
Campi di applicazione dei sostituti degli enzimi pancreatici
I prodotti enzimatici PerfCell Tryzyme™ Express sono altamente puri, hanno pochi danni cellulari, sono delicati nella digestione e possono essere conservati stabilmente a temperatura ambiente, il che li rende un enzima digestivo ideale per diverse colture di linee cellulari. Questo tipo di prodotto non richiede l'uso di inibitori della tripsina per l'inattivazione e non contiene origine animale, il che è più adatto ad alcuni esperimenti di cellule aderenti alla crescita senza siero.
Informazioni sull'area di applicazione della dispasi
Dispase II dispase II, una metalloproteinasi non specifica, è comunemente usata in biologia cellulare per isolare singole cellule da tessuti o organi diversi, ed è usata in colture cellulari successive, come l'isolamento di cellule primarie, il passaggio cellulare, ecc., e può anche essere usata per eliminare l'aggregazione cellulare che si verifica durante la coltura cellulare in sospensione. Rispetto ad altre proteasi comunemente usate in biologia cellulare (ad esempio, tripsina, collagenasi, pronasi, ecc.), questo enzima ha i seguenti vantaggi:
- Enzimi per la digestione cellulare rapidi, efficaci e delicati, che danneggiano poco le cellule e possono mantenere l'integrità delle membrane cellulari;
- Derivato da batteri, senza contaminazione da micoplasmi o altri virus animali;
- Elevata stabilità, non influenzata da temperatura, pH e componenti del siero;
- Può essere utilizzato per l'isolamento di vari tipi di tessuti e cellule.
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