I micoplasmi, noti anche come organismi simili alla pleuropolmonite (PPLO), sono i più piccoli e semplici procarioti finora scoperti che non hanno una parete cellulare. Hanno un diametro da 0,1 a 0,3 μm, possono passare attraverso i filtri e mostrano un elevato pleomorfismo. Sono relativamente comuni e difficili da rilevare contaminanti batterici nelle colture cellulari dei mammiferi
La contaminazione da micoplasma ha molteplici effetti avversi sulle colture cellulari ed è diventata un problema serio nelle pratiche di coltura cellulare. Si stima prudentemente che il tasso di contaminazione da micoplasma nelle colture cellulari di routine vari dal 15% al 35%, il che interferisce seriamente con la credibilità dei risultati sperimentali.
Circa il 95% della contaminazione da micoplasma nelle colture cellulari è causata principalmente da Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis e Mycoplasma hyorhinis. Sui terreni di coltura, le colonie di micoplasma formano un aspetto a "uovo fritto". I surnatanti delle colture cellulari e le membrane cellulari forniscono un ambiente adatto alla crescita del micoplasma e i micoplasmi che parassitano la superficie delle cellule possono penetrare la membrana della cellula ospite.
Le principali fonti di contaminazione da micoplasma includono: terreni di coltura cellulare o i loro componenti (come materie prime per il terreno, siero e altri reagenti), personale di laboratorio, incubatori per colture cellulari, serbatoi di stoccaggio di azoto liquido, particelle e aerosol sospesi nell'aria, uso eccessivo di antibiotici, colture cellulari non sigillate correttamente e cellule già contaminate da micoplasma.
Nel frattempo, i rischi corrispondenti di queste contaminazioni includono: portare allo scarto di lotti di prodotti cellulari o di prodotti realizzati utilizzando le cellule come mezzo a causa dell'incapacità di rimuovere efficacemente il micoplasma durante la purificazione a valle; contaminare tutte le attrezzature e le strutture correlate, nonché i prodotti intermedi o finali, che entrano in contatto con il materiale contaminato; causare la contaminazione di altre cellule normali da parte del micoplasma; causare lo scarto di importanti banche di semi cellulari o virali a causa della contaminazione da micoplasma; costringere il laboratorio a interrompere la produzione o le operazioni sperimentali per affrontare la contaminazione da micoplasma; portare allo sviluppo di resistenza al micoplasma, rendendolo ancora più difficile da eliminare; espandere l'area di contaminazione da micoplasma; e rappresentare una minaccia per altre colture cellulari in laboratorio.
Pertanto, è necessario effettuare regolarmente test e la rimozione del micoplasma per garantire che non sia presente alcun micoplasma nel sistema di coltura cellulare, il che è essenziale per il normale progresso della ricerca scientifica.
Micoplasma Rilevamento
Il micoplasma è un tipo di contaminazione relativamente comune ma solitamente difficile da rimuovere. Per i processi biologici che coinvolgono la coltura cellulare, le normative richiedono che "non ci debba essere contaminazione da micoplasma".
- L'edizione 2020 della Farmacopea cinese, volume III, "Preparazione e controllo di qualità di substrati di cellule animali per la produzione e il collaudo di prodotti biologici", stabilisce che per le cellule utilizzate nella produzione, il test del micoplasma deve essere condotto sulla Master Cell Bank (MCB), sulla Working Cell Bank (WCB) e sulle cellule di fine produzione (EOPC).
- La FDA, Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indicazionis, stabilisce che il controllo del micoplasma deve essere eseguito su materie prime, semi del virus, fluidi di raccolta non trattati e altri materiali simili.
- Anche l'ICH Q5D, "Derivazione e caratterizzazione di substrati cellulari utilizzati per la produzione di prodotti biotecnologici/biologici", menziona che il controllo del micoplasma deve essere eseguito su materie prime, semi di virus, fluidi di raccolta non trattati e altri materiali simili.
Figura 1 Punti di prova per la contaminazione da micoplasma richiesti dalle normative nazionali e internazionali
I metodi tradizionali di rilevamento del micoplasma includono principalmente metodi di coltura e metodi di cellule indicatrici. Tuttavia, a causa dei lunghi cicli di rilevamento o dei problemi di sensibilità di questi due metodi, essi comportano cicli di produzione o rilascio del prodotto estesi per le aziende. Con lo sviluppo della terapia cellulare e genica, i requisiti del settore per la tempestività e la sensibilità del rilevamento del micoplasma sono diventati sempre più rigorosi. Brevi periodi di conservazione non sono sufficienti per supportare periodi di rilevamento così lunghi, motivo per cui il metodo rapido NAT (Nucleic Acid Testing) si è distinto tra i vari metodi di rilevamento del micoplasma.
Figura 2 Metodi di rilevamento del micoplasma elencati nelle normative nazionali e internazionali
Basandosi sulle tecniche NAT (nucleic acid amplification techniques), Yeasen ha sviluppato una serie di kit per la rilevazione rapida del micoplasma, tra cui il Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit, il MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit e il GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit.
1.Kit di rilevamento qPCR in tempo reale del micoplasmaÈ un prodotto per la rapida rilevazione qualitativa di potenziali contaminazioni da micoplasma in materie prime di produzione, banche cellulari, semi virali, fluidi di raccolta virale o cellulare e cellule terapeutiche. È utilizzato principalmente nei processi di ricerca, sviluppo, produzione e rilascio di prodotti biofarmaceutici.
Qualifiche del prodotto
Conformità normativa: Validato secondo i requisiti delle farmacopee EP2.6.7, JP G3 e USP 63, soddisfacendo gli standard di autorevoli organizzazioni internazionali.
Conformità di revisione: La produzione del prodotto è conforme agli standard del sistema di gestione della qualità ISO13485 ed è supportata da una documentazione di audit completa.
Garanzia di qualità: Tutte le materie prime enzimatiche necessarie per il kit sono autoprodotte e industrializzate, garantendo una fornitura stabile.
Accumulo di esperienza tecnica: Il metodo TaqMan si basa su solide basi tecniche e la sensibilità del kit può raggiungere e superare i 10 CFU/mL.
Concentrarsi sulle prestazioni del prodotto: La libreria di anticorpi dell'enzima Taq, con anticorpi a doppio blocco, migliora la specificità, la sensibilità e la stabilità del kit.
Caratteristiche del prodotto
Tipi di rilevamento multipli: Le sonde TaqMan ottimizzate possono rilevare fino a 183 specie di micoplasmi.
Facile da usare: Il tempo totale per la preparazione e l'analisi del campione è inferiore a 3 ore, eliminando la necessità di attendere 28 giorni associata ai metodi di coltura.
Alta sensibilità: Il limite di rilevamento è basso, pari a 10 CFU/mL, il che lo rende una valida alternativa ai metodi di coltura diretta.
Elevata specificità: I primer e le sonde sono progettati per colpire l'rRNA 16S, evitando così reazioni crociate con specie strettamente correlate, come clostridi e lattobacilli.
Alta sicurezza: Il controllo positivo (PC) nel kit non è infettivo, eliminando completamente il rischio di contaminazione.
Forte resistenza alle interferenze: L'introduzione di un controllo interno (CI) aiuta a escludere interferenze del campione e anomalie nella preparazione della reazione, evitando efficacemente falsi negativi.
Figura 3 Flusso di lavoro per il rilevamento del micoplasma mediante il kit di rilevamento qPCR in tempo reale del micoplasma
2.Kit di rilevamento del micoplasma in un unico passaggio MycAway™ Plus-ColorUtilizza una tecnologia di amplificazione isotermica unica, che offre una discriminazione cromatica più elevata. Il passaggio dal blu-violetto (negativo) all'azzurro cielo (positivo) è più facilmente percepibile a occhio nudo. Inoltre, include componenti anti-contaminazione per eliminare il verificarsi di falsi positivi.
Figura 4: Procedura operativa per il rilevamento del micoplasma utilizzando il kit di rilevamento del micoplasma in un unico passaggio MycAway™ Plus-Color
3.GMyc-PCR Micoplasma RilevamentoKitA differenza dei metodi di rilevamento PCR one-step convenzionali, il numero di primer è aumentato da una coppia a tre coppie, prendendo di mira le regioni conservate dell'rRNA 16S e 23S del micoplasma per l'amplificazione PCR nidificata. Ciò non solo riduce i prodotti non specifici, ma aumenta anche significativamente la sensibilità del prodotto, consentendo il rilevamento di una sola copia del micoplasma.
,
Figura 5 Procedura operativa per il rilevamento del micoplasma utilizzando il kit di test del micoplasma GMyc-PCR
Rimozione del micoplasma
Nel processo di coltura cellulare, test regolari possono prevenire efficacemente la contaminazione da micoplasma su larga scala. Tuttavia, se le cellule sono già contaminate da micoplasma, devono essere gestite tempestivamente. La migliore pratica è sterilizzare le cellule contaminate ad alta pressione e poi scartarle per evitare di contaminare altre linee cellulari pulite. Se le cellule contaminate sono particolarmente preziose ed è necessario rimuovere la contaminazione da micoplasma, è possibile utilizzare una combinazione di antibiotici per raggiungere questo obiettivo. Poiché i micoplasmi non hanno una parete cellulare, gli antibiotici tradizionali sono generalmente inefficaci contro di loro. Pertanto, è fondamentale selezionare un reagente di rimozione del micoplasma appropriato.
Il trattamento MycAway™ di Yeasen (1000×) è una preparazione antibiotica mista che contiene tre componenti con effetti antimicrobici sul micoplasma: chinoloni, derivati della tetraciclina e antibiotici macrolidi. Questo reagente per la rimozione del micoplasma ottiene un'efficace clearance del micoplasma inibendo la sintesi del DNA e la produzione di proteine essenziali per la crescita del micoplasma, senza danneggiare le cellule. Massimizza il recupero cellulare e riduce al minimo le perdite dovute alla contaminazione da micoplasma.
Caratteristiche del prodotto
Bassa tossicità: Tossicità minima per le cellule, che garantisce l'assenza di interferenze con successivi esperimenti cellulari, come la trasfezione e i test di vitalità.
Elevata stabilità: Il reagente può essere conservato a lungo a -20°C mantenendo la sua elevata efficacia.
Facile da usare: Basta aggiungere il prodotto al terreno di coltura contaminato dal micoplasma e incubare.
Azione rapida: 'Risultati immediati', con effetti visibili già entro 3 giorni.
Ampio spettro: In grado di rimuovere la maggior parte dei tipi di micoplasmi presenti nei laboratori.
Figura 6.Illustrazione del test di citotossicità del reagente di rimozione del micoplasma
Prevenzione del micoplasma
Nel processo di coltura cellulare, spesso si verifica la contaminazione da micoplasma. Tuttavia, a causa delle sue caratteristiche uniche, è difficile rilevarla a occhio nudo o con apparecchiature microscopiche. Pertanto, è particolarmente importante fare un buon lavoro nella prevenzione del micoplasma. Una prevenzione efficace della contaminazione da micoplasma può essere ottenuta aggiungendo reagenti di prevenzione del micoplasma al terreno di coltura.
Attualmente, il micoplasma nei laboratori deriva principalmente da: contaminazione incrociata tra cellule, contaminazione dell'ambiente di lavoro o delle attrezzature di laboratorio, scarse tecniche asettiche da parte degli sperimentatori, terreni di coltura o reagenti contaminati e tessuti o organi originali con contaminazione da micoplasma. La serie di prodotti per la prevenzione del micoplasma sviluppata da Yeasen è caratterizzata da semplicità, praticità ed elevata stabilità, il che la rende molto adatta per la prevenzione del micoplasma nelle colture di linee cellulari di routine.
Informazioni sul prodotto
| Prodotto | Numero di catalogo | Nome del prodotto | specifiche del prodotto |
| Kit di pretrattamento del campione | 18461ES | Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico MolPure® | 25T/100T |
| 18467ES | Kit di preparazione del campione MolPure® Mag48 FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Strumento per l'estrazione degli acidi nucleici | 80511ES | Estrattore automatico di acidi nucleici a 48 canali | 48 Canale |
|
Kit di rilevamento del micoplasma | 40619ES | Kit di rilevamento qPCR in tempo reale del micoplasma MycAway® (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | Kit di rilevamento del micoplasma in un unico passaggio MycAway™ Plus-Color | 25T/100T | |
| 40601ES | 10 analisi/20 analisi | ||
| Reagente per la rimozione del micoplasma | 40607ES | Il mio vialeTM Trattamento (1000×) - Reagente per la rimozione del micoplasma | 1 ml/5 × 1 ml
|
|
Reagente di prevenzione del micoplasma | 40608ES | Il mio vialeTM Profilattico (2000×) -Reagente di prevenzione del micoplasma | 1 ml/5 × 1 ml
|
| 40605ES | Il mio vialeTM Spray (Pronto all'uso) | 500 ml/2×500 ml/10×500 ml
| |
| 40609ES | Il mio cGuardTM-1 Soluzione (100×), per disinfettare il bagno d'acqua dell'incubatrice di CO2 | 100 ml | |
| 40610ES | Il mio cGuardTM-2 Soluzione (500×), per la disinfezione del bagno d'acqua ordinario | 100 ml |