Background – Che cosa è ROS
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono un normale prodotto del metabolismo cellulare: molecole bioattive contenenti ossigeno, tra cui perossido, superossido, radicale idrossilico, ossigeno singoletto e ossigeno α, ecc., che svolgono un importante ruolo regolatore nei percorsi di segnalazione cellulare e nella trascrizione, come l'apoptosi, l'autofagia, l'invecchiamento, il cancro, ecc.
Effetto della concentrazione di ROS sulle cellule: perché rilevare i ROS?
A bassi livelli di specie reattive dell'ossigeno, le ROS sono coinvolte nella segnalazione e nella regolazione intracellulare come "messaggeri redox". Tuttavia, sotto stress ambientali (ad esempio, radiazioni ionizzanti, esposizione al calore, raggi ultravioletti, ipossia, ecc.), i livelli di ROS aumentano drasticamente, il che può causare danni al DNA, inibire l'espressione genica, portare a un ripiegamento errato delle proteine e persino influenzare la sintesi proteica, causando gravi danni alle strutture cellulari, il che è noto come stress ossidativo.
Quando i livelli di ROS superano la capacità delle difese antiossidanti endogene, l'equilibrio redox viene interrotto, provocando cambiamenti strutturali o conformazionali nel DNA, nei lipidi, nelle proteine e, in ultima analisi, nella morte cellulare.
Il livello di ROS è un segnale importante del danno cellulare causato da normali funzioni fisiologiche e fattori ambientali, e il rilevamento del livello di ROS intracellulare è di grande importanza per comprendere i percorsi di segnalazione e i potenziali meccanismi di azione di alcuni farmaci. Pertanto, la selezione di sonde appropriate per il rilevamento di ROS svolge un ruolo importante nella ricerca sui meccanismi delle malattie e nello screening dei farmaci.
Come funziona il rilevamento delle ROS?
IL Kit di analisi delle specie reattive dell'ossigeno (CAT# 50101ES01) è il metodo più comunemente utilizzato per quantificare i livelli di specie reattive dell'ossigeno intracellulare basato sulle variazioni dell'intensità di fluorescenza del colorante fluorescente DCFH-DA (diacetato di 2,7-diclorodiidrofluoresceina).
La DCFH-DA stessa non ha fluorescenza e può passare liberamente attraverso la membrana cellulare e, dopo essere entrata nella cellula, può essere idrolizzata dalle esterasi intracellulari per produrre DCFH. Tuttavia, la DCFH non può penetrare la membrana cellulare, rendendo facile l'etichettatura e l'aggregazione della sonda all'interno della cellula. Le specie reattive dell'ossigeno intracellulari sono in grado di ossidare la DCFH non fluorescente per formare DCF fluorescente. L'intensità della fluorescenza verde della DCF è direttamente proporzionale al livello delle specie reattive dell'ossigeno intracellulari e il livello delle specie reattive dell'ossigeno intracellulari può essere noto rilevando la fluorescenza della DCF.
Nelle condizioni di lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e lunghezza d'onda di emissione di 525 nm, la fluorescenza DCF è stata rilevata tramite microscopio a fluorescenza, microscopio confocale laser, spettrofotometro a fluorescenza, lettore di micropiastre a fluorescenza, citofluorimetro, ecc., in modo da determinare il livello di specie reattive dell'ossigeno intracellulare.
Letteratura pubblicata dai clienti che utilizzano questo prodotto (alcuni esempi)
A settembre 2022, sono stati pubblicati complessivamente 164 articoli sul kit di rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno ROS (50101ES01), con un fattore di impatto totale di 913,72.
Effetto della produzione di ROS sulla polarizzazione dei macrofagi e sull'uccisione delle cellule tumorali （PMID: 35665496; PMID: 35301299; Italiano:
Domande frequenti
D1: Quali campioni sono adatti per i test ROS?
A1: Viene generalmente utilizzato per il rilevamento di cellule di mammifero ed è adatto solo per il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno in cellule vive o in vivo.
D2: Il kit per il test ROS è adatto per la rilevazione nel siero o nel plasma?
A2: Non adatto per la rilevazione di ROS in siero o omogenato di tessuto. Si possono provare sospensioni monocellulari preparate con tessuto fresco.
D3: È possibile rilevare piante o batteri?
A3: È adatto solo per il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno in cellule vive o in vivo, perché l'emivita dei radicali idrossilici e dei radicali superossido dell'ossigeno è molto breve ed è adatto solo per il rilevamento di cellule vive. Piante o batteri, che possono essere utilizzati per il rilevamento dopo la preparazione di protoplasti, questo kit non può rilevare ROS in vivo.
D4: Come posso evitare un'eccessiva fluorescenza di fondo?
A4: Dopo l'incubazione della sonda, assicurarsi di lavare via tutte le sonde rimanenti che non sono entrate nella cellula.
D5: Posso rilevare la quantità di ROS nelle cellule normali?
A5: Il contenuto di specie reattive dell'ossigeno nelle cellule normali è molto basso e l'effetto di rilevamento potrebbe non essere molto buono.
D6: I valori di fluorescenza negativi e positivi sono gli stessi, cosa sta succedendo?
A6: Potrebbe essere causato da una concentrazione troppo elevata della sonda aggiunta. Si consiglia di ridurre la concentrazione della sonda di 5-7,5 μM e il tempo di incubazione di 15-20 min.
D7: La fluorescenza del controllo positivo è debole, cosa sta succedendo?
A7: Il controllo positivo Rosup era solitamente concentrato a 100 μM e si è osservato un aumento significativo delle specie reattive dell'ossigeno 30 min-4 h dopo la stimolazione. L'effetto del controllo positivo delle specie reattive dell'ossigeno può variare notevolmente tra cellule diverse. Se l'aumento delle ROS non viene osservato entro 30 minuti dalla stimolazione, il tempo di induzione può essere esteso o la concentrazione di Rosup può essere aumentata in modo appropriato.
A8: La stessa sonda, non divisa, le prime 5 volte l'effetto è molto buono, questa volta non è tinta, qual è il problema?
D8: 1. Lo stato cellulare non è buono, con conseguente bassa efficienza di colorazione; 2. Il tempo di induzione del farmaco positivo è troppo breve e il livello di specie reattive dell'ossigeno può essere aumentato significativamente incubando a 37 °C al buio per 30 min-4 h; 3. La sonda è stata congelata e scongelata più di 4 volte, l'efficienza di colorazione è ridotta e il segnale di fluorescenza è instabile (a volte forte, a volte debole e facile da spegnere). Si raccomanda di suddividere le sonde e conservarle in un congelatore a -20 °C al riparo dalla luce per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
D9: Quali strumenti possono essere utilizzati per i test?
A9: Il microscopio a fluorescenza, il microscopio confocale laser, lo spettrofotometro a fluorescenza, il lettore di micropiastre a fluorescenza, il citometro a flusso, ecc. possono rilevare i valori di fluorescenza.
Pubblicazioni di ricerche scientifiche pubblicate dai clienti che utilizzano questo prodotto (parziale)
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[3] Zhang D, et al. Microcarrier orali a base di microalghe per l'omeostasi del microbiota intestinale e la protezione intestinale nel cancro radioterapia. Nat Commun. 2022 17 marzo;13(1):1413. doi: 10.1038/s41467-022-28744-4. PMID: 35301299. SE: 14.919
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[20] Sun C, et al. L'eliminazione del selenossido manipola lo stress ossidativo per migliorare l'efficacia antitumorale. Biomateriali. 2019 dicembre; 225:119514. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119514. Epub 2019 settembre 24. PMID: 31569018. SE: 10.273
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