Tuttavia, la T4 DNA Ligase deve ancora affrontare alcune sfide nelle applicazioni pratiche, tra cui scarsa stabilità, elevata legatura adattatore-adattatore o bassa resa della libreria di DNA. Questi problemi possono portare a una ridotta efficienza sperimentale, una qualità dei dati ridotta, scarsa ripetibilità dei risultati sperimentali e bassa purezza del prodotto, influenzando così l'efficacia complessiva degli esperimenti di biologia molecolare e l'accuratezza dei dati di sequenziamento. Per affrontare questi problemi, Yeasen, sulla base dell'innovativo ZymeEditor della sua sussidiaria Molefuture^™ La piattaforma di evoluzione enzimatica ha eseguito l'evoluzione enzimatica sulla DNA ligasi T4.

Fig 1 Diagramma schematico del principio di reazione della T4 DNA Ligasi^[1]

Fig 2 Struttura della DNA ligasi T4

Oltre alla progettazione razionale, l'evoluzione diretta della DNA ligasi T4 è stata condotta con il metodo MTPS esaminando la stabilità, l'attività e l'attività residua. E una libreria di oltre 10⁴ mutanti è stato selezionato. Dopo un'analisi approfondita dei dati di mutazione, i candidati promettenti sono stati selezionati per la purificazione e test rigorosi. Quindi tutti i vincitori ottenuti tramite progettazione razionale ed evoluzione diretta sono stati sottoposti a caratterizzazione dettagliata dopo purificazione raffinata, comprendente valutazioni di attività, stabilità, autolegatura dell'adattatore, autolegatura del frammento di DNA e resa del DNA. Sulla base dei mutanti G1, il team hanno eseguito il rimescolamento del DNA e hanno combinato la progettazione di mutazioni dirette per ottenere mutanti eccezionali che soddisfano diversi requisiti applicativi.

Da mutante a prodotto di mercato con più round di convalida del sequenziamento

IL Editore di Zyme^TM La piattaforma di evoluzione enzimatica ha sviluppato con successo un mutante della DNA ligasi T4 con elevata stabilità termica, elevata resa della libreria e bassa autolegatura dell'adattatore attraverso la tecnologia di evoluzione enzimatica. È stata lanciata con successo la T4 DNA Ligase attualmente migliorata: Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Questo prodotto supera la tradizionale DNA ligasi T4 di tipo selvatico in termini di efficienza di legatura e stabilità termica, ed è stato verificato mediante sequenziamento ad alto rendimento, garantendo un'eccellente qualità.

Presentazione dei dati

1. Maggiore stabilità termica

I mutanti della DNA ligasi T4 di Yeasen sono stati sottoposti a trattamento termico a 42℃ per 0, 2 e 4 ore e sono stati confrontati con le DNA ligasi T4 dei fornitori Q, N, A e T.Successivamente, è stata costruita una libreria di DNA del genoma intero utilizzando 1 µg di gDNA bovino frammentato con il Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) per confrontare la stabilità termica della T4 DNA Ligasi.

Fig 3 Test di stabilità termica a 42℃

Risultati:

Stabilità termica: Yeasen ≈ Fornitore N ≈ Fornitore A > Fornitore T > Fornitore Q.

2. Maggiore rendimento della biblioteca

Il mutante della DNA ligasi T4 di Yeasen è stato testato per la resa della libreria sia a livelli di input di DNA alti che bassi, rispetto alle DNA ligasi T4 del fornitore Q, N, A e T. È stato utilizzato il kit di costruzione della libreria di DNA di Yeasen (Cat#12927ES), con 1 µg e 0,5 ng di gDNA bovino frammentato come input per costruire le librerie di DNA.

Fig. 4 Analisi della resa della libreria di DNA

Risultati:

Resa della libreria (1 µg gDNA): Yeasen > Fornitore Q ≈ Fornitore T ≈ Fornitore A > Fornitore N. Resa della libreria (0,5 µg gDNA): Yeasen ≈ Fornitore Q ≈ Fornitore A ≈ Fornitore T > Fornitore N.

3. Adattatore inferiore autolegante

Il mutante T4 DNA Ligase di Yeasen è stato confrontato con le T4 DNA Ligase di Vendor Q, N, A e T per l'autolegatura dell'adattatore. È stato utilizzato il Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES), con 0 ng e 0,5 ng di gDNA bovino frammentato come input per costruire librerie di DNA dell'intero genoma.

Fig 5 Dati di autolegatura dell'adattatore con input gDNA da 0 ng (sinistra) e 0,5 ng (destra)

Risultati:

1) Tasso di autolegatura dell'adattatore (0 ng gDNA): Fornitore N > Yeasen > Fornitore T > Fornitore A > Fornitore Q.

2) Tasso di autolegatura dell'adattatore (0,5 ng di gDNA): Yeasen > Fornitore T > Fornitore Q ≈ Fornitore N > Fornitore A.

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Yeasen ha superato con successo i limiti delle tradizionali DNA ligasi T4, offrendo un prodotto di DNA ligasi T4 che eccelle in stabilità termica, resa della libreria e autolegatura dell'adattatore. In questo processo, l'azienda ha accumulato una ricca libreria di mutanti, offrendo ai ricercatori una varietà di opzioni per soddisfare diverse esigenze sperimentali. Se sei interessato ai nostri prodotti o ai mutanti di DNA ligasi T4, non esitare a contattarci tramite i seguenti metodi.

E-mail: order1@yeasen.com (NOI)

Telefono: +1 240-472-6069 (USA)

Inoltre, Yeasen offre una gamma di serie di prodotti T4 DNA ligase. Clicca sul link del prodotto per richiedere informazioni sul prodotto

Riferimenti

[1] Shuman S .DNA Ligasi: Progressi e Prospettive[J].Rivista di chimica biologica, 2009, 284(26):17365-17369.