RNasi HII, nota anche come RNasi H2, è un'endoribonucleasi che prende di mira e recide specificamente il legame fosfodiesterico all'estremità 5' di un ribonucleotide solitario incastonato in un'elica di DNA a doppio filamento, producendo un gruppo fosfato 5' e un gruppo idrossilico 3' (Fig. 1). Questo enzima mostra un'attività di scissione minima verso l'RNA a singolo filamento ed è inattivo sia contro il DNA a doppio filamento (dsDNA) che contro il DNA a singolo filamento (ssDNA). Funzionalmente attiva nell'intervallo di temperatura da 50°C a 75°C, RNasi HII raggiunge le massime prestazioni a temperature comprese tra 70°C e 75°C. Sfruttando la sua capacità unica di eseguire una scissione mirata a singolo sito nei siti del DNA in cui è integrato un ribonucleotide, senza influenzare dsDNA o ssDNA, RNase HII funge da "trigger" di precisione per l'inizio della reazione, inclusa l'attivazione e l'estensione del primer, per ottenere un'amplificazione specifica. Questo enzima svolge un ruolo fondamentale nella PCR dipendente da RNase H (rhPCR), nella tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) e nella degradazione dei componenti dell'RNA nei frammenti di Okazaki.

PCR dipendente da RNasi H(PCR-rh)
L'rhPCR incorpora RNase HII e primer rhPCR chiusi e scindibili appositamente progettati nel processo PCR. Questo approccio sfrutta la proprietà unica di RNase HII di idrolizzare selettivamente l'RNA all'interno di ibridi DNA-RNA, lasciando intatti i legami fosfodiesterici nel DNA e nell'RNA a singolo o doppio filamento. Di conseguenza, RNase HII digerisce solo l'ibrido DNA-RNA e consente l'estensione del primer quando il primer è perfettamente complementare alla sequenza di DNA target. Questa azione mirata migliora significativamente l'accuratezza della reazione. RNase HII è l'unico enzima in grado di avviare la rimozione precisa dei ribonucleotidi senza indurre mutazioni scindendo all'estremità 5' dell'acido ribonucleico. Grazie alla sua elevata specificità, sensibilità e riproducibilità, rhPCR offre vantaggi distinti in applicazioni quali il rilevamento di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), la tipizzazione genetica, il rilevamento simultaneo di più target e l'analisi degli acidi nucleici ambientali.

Percorso Tecnico

1. Progettazione del primer

Il design del primer deve garantire che la temperatura di fusione dopo il taglio sia superiore alla temperatura di annealing per garantire che il primer si leghi stabilmente al modello durante i cicli di PCR. Il primer rhPCR è costituito da tre parti:

1) Segmento di DNA 5': paragonabile per lunghezza e requisiti di temperatura di fusione (Tm) ai primer PCR standard, può efficacemente appaiarsi ed estendersi dal DNA stampo dopo essere stato tagliato dall'enzima RNasi HII.

2) Una singola base di RNA: fornisce un sito di taglio per la RNasi HII.

3）Segmento di DNA 3': una lunghezza di quattro o cinque basi con un bloccante, in genere una molecola corta e non estensibile come il glicole propilenico, che impedisce l'estensione della DNA polimerasi finché il bloccante non viene rimosso.

2.Taglio ed estensione

All'inizio della reazione rhPCR, il primer e il DNA stampo sono liberi. Quando il primer si lega allo specifico stampo eteroduplex RNA:DNA, la base RNA lato 5' del primer bloccato viene riconosciuta e tagliata dall'enzima RNasi HII, lasciando un oligonucleotide di DNA con un gruppo 3'-idrossile, che fornisce un punto di partenza per l'estensione della DNA polimerasi. Questo è seguito dal processo di amplificazione PCR convenzionale.

Fig 2. Diagramma del principio rhPCR ^[1]

Sì.Amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP)

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un metodo semplice e rapido per l'amplificazione genica che può amplificare gli acidi nucleici in condizioni isotermiche in un breve periodo di tempo. Tuttavia, a causa dell'avvio dell'attività della DNA polimerasi durante la preparazione a temperatura ambiente, si formano delle discrepanze non specifiche, che possono portare a una piccola quantità di mispairing e dimeri di primer, causando piccole contaminazioni che possono dare luogo a falsi positivi.
L'applicazione di RNase HII al sistema di amplificazione LAMP può affrontare efficacemente il problema dei falsi positivi nella tecnologia LAMP, ampliandone l'applicazione nella diagnostica clinica. Come mostrato nella Fig. 3, il metodo LAMP attivato da primer (PA-LAMP) che utilizza RNase HII, quando il primer si accoppia con l'ssDNA target, l'enzima RNase HII scinde specificamente l'RNA sul primer, attivandolo e consentendo l'estensione del primer, ottenendo un'amplificazione specifica e riducendo efficacemente i falsi positivi nel sistema.

YEASEN RNasi HII

RNasi HII di YEASEN (Cat#14539) è derivato da Pyrococcus abyssi, Pa, ed è privo di nucleasi contaminanti, enzimi di nicking e residui di RNasi, con bassa contaminazione del DNA ospite, riducendo efficacemente i falsi positivi nel sistema. La RNasi HII di YEASEN è estremamente resistente al calore, mantenendo la sua attività anche dopo 30 minuti a 95°C, rendendola compatibile con vari sistemi di reazione rhPCR e adatta anche per LAMP e altre applicazioni.

1. Escherichia coli residuo di DNA genomico < 0,5 copie/100 U

Rilevamento di Escherichia coli Il residuo di DNA genomico in diversi lotti di RNasi HII ha mostrato che il residuo di DNA genomico dell'ospite di RNasi HII di YEASEN è ben al di sotto di 0,5 copie/100 U.

Fig 4. Rilevamento di Escherichia coli residuo di DNA genomico

2. Test di resistenza al calore a 95°C

Dopo aver riscaldato RNase HII a 95°C per 0-45 minuti, è stata testata l'attività enzimatica di RNase HII. I risultati hanno indicato che non vi era quasi nessuna perdita di attività enzimatica in RNase HII di YEASEN anche dopo 45 minuti di riscaldamento.

Fig 5. Prova di resistenza al calore a 95°C

3. Nessuna esonucleasi, enzima di nicking o residuo di RNasi (dose da 1 U)

Incubando 1 U di diversi lotti di RNasi HII con i rispettivi substrati DNA/RNA a 37°C per 4 ore, i risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio hanno indicato che non erano presenti esonucleasi, enzimi di nicking o residui di RNasi in RNasi HII.

Figura 6.Risultati del rilevamento di esonucleasi, enzima di nicking e residuo RNasi

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Riferimenti

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. PCR dipendente da RNasi H (rhPCR): miglioramento della specificità e rilevamento del polimorfismo a singolo nucleotide utilizzando primer scindibili bloccati. BMC Biotechnol. 2011 10 agosto;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. Rilevamento in un unico passaggio e ad alta specificità di mutazioni a singolo nucleotide mediante amplificazione isotermica mediata da loop attivabile da primer (PA-LAMP) [J]. Analytica chimica acta, 2019 (1050-): 1050. DOI: 10.1016 / j.aca. 2018.10.068.