Figura 1. Diagramma schematico della scissione del dsDNA da parte della DNasi I in presenza di Mg²⁺ e Mn²⁺

La DNasi I comune è principalmente purificata dal pancreas bovino o è un enzima ricombinante. Rispetto alla DNasi I purificata dal pancreas bovino, la DNasi I ricombinante ha livelli di RNasi endogena relativamente più bassi o può essere formulata come prodotti privi di RNasi, rendendola più adatta per applicazioni sensibili alla RNasi, come la rimozione del DNA dai campioni di RNA.

Applicazioni

Per quanto riguarda le applicazioni, la DNasi I è ben nota per il suo utilizzo in esperimenti correlati al mantenimento dell'integrità dell'RNA, come l'estrazione di RNA privo di DNA, la preparazione di modelli di RNA senza gDNA prima della trascrizione inversa e la degradazione di modelli di DNA dopo la trascrizione in vitro. Inoltre, può essere utilizzata per digerire sonde di DNA nella rimozione di rRNA, per l'etichettatura del DNA tramite traduzione nick, l'analisi delle interazioni DNA-proteina utilizzando il metodo di footprinting, la generazione di librerie di DNA casuali, la riduzione della viscosità di lisati cellulari o estratti proteici, la digestione delle aderenze cellulari come additivo nella coltura cellulare e la scissione parziale del DNA genomico come controllo positivo nei test TUNEL per il rilevamento dell'apoptosi. In sintesi, la DNasi I può essere utilizzata in quasi tutte le applicazioni che richiedono la digestione enzimatica del DNA. Di seguito, verrà fornita una breve introduzione a diverse applicazioni comuni.

• Rimozione del gDNA prima dell'estrazione dell'RNA o della trascrizione inversa

L'RNA, come campione comunemente studiato nei laboratori, influenza notevolmente la qualità dei dati sperimentali a causa della sua stessa qualità. È generalmente impossibile evitare completamente il residuo di gDNA durante il processo di estrazione dell'RNA. Pertanto, prima di condurre applicazioni downstream impegnative (come analisi dell'espressione di mRNA, analisi del trascrittoma, ecc.), di solito si consiglia di trattare i campioni di RNA con DNasi I per digerire il gDNA residuo. La digestione del gDNA può essere eseguita durante l'estrazione dell'RNA, dopo l'estrazione dell'RNA o prima della trascrizione inversa dell'RNA.

Figura 2. Processo di rimozione del gDNA basato sulla DNasi I

• Rimozione del DNA stampo nella trascrizione in vitro

La trascrizione in vitro (IVT) utilizza principalmente il DNA come stampo per produrre RNA sotto l'influenza di substrati e tamponi appropriati. Le RNA polimerasi comunemente utilizzate in questo processo includono T7, T3 e SP6, che sono responsabili della catalizzazione della sintesi di RNA. Tuttavia, il prodotto di RNA sintetizzato può contenere residui di DNA e l'eliminazione di questi residui è vantaggiosa per gli esperimenti a valle.

Soprattutto nel processo di sviluppo dei vaccini a mRNA, la rimozione di questi residui di DNA è un passaggio fondamentale che influisce direttamente sulla difficoltà dei successivi processi di purificazione e sulla purezza del prodotto finale.Per eliminare in modo efficiente il DNA stampo, in genere si utilizza la DNasi I per garantire che il campione di RNA sia privo di residui di DNA, un passaggio che contribuisce a migliorare l'accuratezza e l'efficienza complessive dell'esperimento.

Figura 3: Processo di trascrizione in vitro utilizzando il plasmide linearizzato come modello^[4]

• Rimozione dell'rRNA nella costruzione e nel sequenziamento della libreria di RNA

Negli organismi, l'rRNA è molto abbondante e altamente conservato, il che è di scarsa importanza per ottenere informazioni di ricerca biologica. Tuttavia, il 95% dell'RNA totale estratto durante gli esperimenti è rRNA umano e la presenza di questi rRNA può interferire con il rilevamento degli RNA target. Pertanto, nella preparazione e nel sequenziamento della libreria di RNA, l'rRNA viene solitamente rimosso per primo. Attualmente, il metodo principale per la rimozione dell'rRNA è la digestione con RNAasi e il suo principale i passaggi e i principi sono i seguenti:

1. Estrarre l'RNA totale;
2. Ibridare sonde di DNA a singolo filamento con molecole di rRNA (Nota: progettare e sintetizzare sonde di DNA a singolo filamento specifiche per rRNA);
3. La RNasi H degrada l'rRNA ibridato;
4. La DNasi I degrada le sonde del DNA;
5. L'rRNA viene rimosso con successo, lasciando dietro di sé modelli di RNA non-rRNA.

Figura 4: Diagramma schematico del principio di rimozione dell'rRNA basato sul metodo enzimatico^[5]

• Traduzione di Nick per l'etichettatura del DNA

La traduzione di Nick è il metodo più comunemente utilizzato per etichettare le sonde di acido desossiribonucleico in laboratorio. Questo metodo è ottenuto tramite l'azione combinata di DNasi I e Escherichia coli DNA Polimerasi I.

Il principio fondamentale è il seguente:

1. Per prima cosa, utilizzare una concentrazione adeguata di DNasi I per creare diverse incisioni a singolo filamento in ogni filamento del DNA a doppio filamento da etichettare, formando terminali idrossilici 3' nei siti delle incisioni.
2. Quindi, utilizzare l'attività esonucleasica 5'→3' di coliDNA Polimerasi I per rimuovere un nucleotide dall'estremità 5' della tacca, mentre l'attività della polimerasi 5'→3' di E. coli La DNA Polimerasi I introduce un nucleotide marcato all'estremità 3' del nick per ripararlo. Mentre il nick si muove lungo il filamento di DNA, i nucleotidi marcati vengono incorporati nel filamento di DNA appena sintetizzato.

Figura 5: Diagramma schematico del principio di etichettatura del DNA mediante traduzione nick^[6]

• Esperimento di analisi dell'impronta della DNasi I

Il test di footprinting della DNasi I è un metodo preciso per identificare i siti di legame delle proteine ​​che legano il DNA sulle molecole di DNA. Il principio è che le proteine ​​legate a un frammento di DNA proteggono la regione legata dalla degradazione da parte della DNasi I. Dopo la digestione enzimatica, il frammento rimanente (il "footprint") può essere utilizzato per determinarne la sequenza. Nell'immagine del gel, non ci sono bande corrispondenti alle regioni in cui la proteina è legata.

Il principio fondamentale è il seguente:

1. Etichettare le estremità a singolo filamento della molecola di DNA a doppio filamento da analizzare.
2. Mescolare la proteina con il DNA e aggiungere una quantità adeguata di DNasi I per la digestione enzimatica, formando frammenti di DNA di diverse lunghezze.La quantità di enzima deve essere controllata per garantire che i frammenti di DNA adiacenti differiscano solo per un nucleotide e, in parallelo, deve essere incluso un controllo senza proteine ​​aggiunte.
3. Rimuovere la proteina dal DNA, separare il DNA denaturato mediante elettroforesi PAGE ed effettuare un'autoradiografia per interpretare la sequenza nucleotidica della regione dell'impronta confrontandola con il gruppo di controllo.

Figura 6: Diagramma schematico del principio del test di footprinting della DNasi I^[7]

IL DNasi I Guida alla selezione di Yeasen

Per soddisfare le diverse esigenze applicative, Yeasen offre ricombinante DNasi I In Escherichia colie può fornire DNasi I di grado GMP per soddisfare i requisiti della trascrizione in vitro dell'mRNA e altre applicazioni.

Posizionamento del prodotto	Applicazione	Nome del prodotto	numero di catalogo
Senza RNasi	rimozione del DNA da preparati di RNA e proteine	DNasi I ricombinante (RNasi-free)	10325ES
Grado GMP, Senza RNasi	Trascrizione in vitro dell'mRNA	UCF.ME® Deossiribonucleasi I (DNasi I) di grado GMP	10611ES

Riferimenti

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. Rilevamento del DNA dell'HPV, mRNA E6/E7 e p16INK4a nei tumori della testa e del collo: una revisione sistematica e meta-analisi[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Confronto tra il carico di DNA virale tipo-specifico dell'HPV oncogenico e il rilevamento di mRNA E6/E7 in campioni cervicali: risultati di uno studio multicentrico[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Ottimizzazione della rimozione del DNA contaminante dall'RNA mediante Dnasi I per l'uso nell'RNA-PCR quantitativa[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Progressi dell'mRNA trascritto in vitro (mRNA IVT) per consentire la traduzione in clinica[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Inattivazione termica irreversibile della DNasi I senza degradazione dell'RNA[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Traduzione in situ dei cromosomi in metafase con d-UTP[J marcato con biotina]. Genetica umana, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Scelta di un metodo adatto per l'identificazione delle origini di replicazione nei genomi microbici. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.