Figura 1. Diagramma schematico della cromatografia di affinità^[1]

Nel campo dell'ingegneria proteica, i tag di fusione servono come un potente strumento, che può facilitare vari scopi sperimentali legandosi alle proteine ​​target. Le funzioni dei tag di fusione comuni sono elencate nella tabella sottostante per riferimento. Tuttavia, una volta che questi tag rimangono sulle proteine ​​di fusione dopo aver svolto le loro funzioni ausiliarie iniziali, potrebbero avere effetti negativi sugli esperimenti successivi, come interferire con gli esperimenti immunologici sugli animali o influenzare l'attività biologica delle proteine. Pertanto, è fondamentale rimuovere questi tag di fusione non necessari per garantire la normale funzione delle proteine ​​e l'accuratezza degli esperimenti.

Tabella 1. Introduzione alle funzioni dei tag di fusione comuni e dei metodi di scissione enzimatica

Figura 2. Diagramma schematico del meccanismo d'azione della proteasi TEV^[2]

Italiano:^TM La proteasi rTEV è una proteasi ricombinante che è stata geneticamente modificata e finemente purificata. Non solo mantiene la piena attività funzionale dell'enzima TEV naturale, ma mostra anche un'eccellente stabilità e specificità su un intervallo di temperatura più ampio. IL residuo di gDNA ospite di til suo prodotto è molto basso, garantendo una maggiore efficienza di taglio dei tag di fusione proteica nelle applicazioni pratiche e riducendo efficacemente il rischio di introdurre residui di sostanze esogene. Italiano:^TM La proteasi rTEV mostra un'attività ottimale nelle condizioni di pH 7,0 e 30°C. Tuttavia, mantiene l'attività anche in un'ampia gamma di condizioni con pH 6,0-8,5 e temperatura 4-30°C, per soddisfare i diversi requisiti di elaborazione delle proteine. Vale la pena menzionare che UCF.ME^TM La proteasi rTEV presenta un tag 6×His al suo terminale N, che può essere rimosso in modo efficiente mediante resina Ni-NTA, ottenendo così una purificazione precisa della proteina target.

Visualizzazione delle prestazioni

1. Elevata efficienza di scissione: il tag proteico viene scisso più a fondo

Utilizzando la proteina di fusione (3 μg) contenente UCF.ME^TM Sito di scissione della proteasi rTEV come substrato, UCF.ME^TM È stata aggiunta rispettivamente la proteasi rTEV a 10, 5 e 3 U e la reazione è stata condotta a 30°C per 1 h. L'effetto di scissione è stato rilevato tramite elettroforesi su gel di agarosio. I risultati hanno mostrato che Yfacilitaredi UCF.ME^TM La proteasi rTEV è in grado di scindere il substrato in modo efficiente quando la quantità di input è superiore a 3 U, con un'efficienza di scissione >90%.

Figura 3. Verifica dell'attività di scissione di UCF.ME^TM Proteasi rTEV

2. Basso residuo di gDNA dell'ospite: riduce efficacemente il rischio di introdurre residui di sostanze esogene

Testando l'host (Escherichia coli) residui di gDNA in diversi lotti di UCF.ME^TM rTEV Proteasi, i risultati hanno mostrato che il residuo gDNA dell'ospite di UCF.ME^TM La proteasi rTEV era ben al di sotto di <1 copia/U.

Figura 4. I risultati del residuo gDNA dell'ospite in UCF.ME^TM Proteasi rTEV

3. Ampie condizioni di applicazione: in grado di soddisfare diverse esigenze di elaborazione delle proteine.

Verificando l'attività di scissione di UCF.ME^TM rTEV Proteasi in diverse condizioni, i risultati hanno mostrato che UCF.ME^TM La proteasi rTEV ha mostrato una forte attività in condizioni di temperatura comprese tra 4 e 30°C, il che potrebbe soddisfare i diversi requisiti applicativi dei clienti.

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Riferimenti:

[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Cromatografia di affinità[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.

[2] Paththamperuma C, Page R C. Saggio di dequenching della fluorescenza per l'attività della proteasi TEV[J]. Biochimica analitica, 2022, 659: 114954.