Con il rapido sviluppo della glicoproteomica e della ricerca sui farmaci anticorpali, anche la modifica della glicosilazione ha attirato molta attenzione. Il contatto tra cellule e cellule, e tra cellule e patogeni, è completato principalmente attraverso l'interazione di zuccheri e proteine, e la glicosilazione determina le proprietà di adesione dei glicoconiugati. Nelle IgG, la glicosilazione N-linked conservata in Asn297 nella regione Fc è anch'essa cruciale per la sua attività. Inoltre, alcuni anticorpi hanno anche N-glicani aggiuntivi, che, insieme al sito conservato in Asn297 nella regione Fc, influenzano il riconoscimento, l'emivita e la risposta immunitaria dell'anticorpo.
La glicosilazione proteica è una complessa modifica post-traduzionale che coinvolge la connessione delle catene glicaniche in siti specifici sulle proteine. A seconda del tipo di catena glicanica, le glicoproteine sono divise in glicoproteine N-linked, glicoproteine O-linked, ecc.; inoltre, la glicosilazione proteica è anche influenzata dal tipo di cellula ospite e dalle condizioni di fermentazione (come terreno di coltura, valore del pH, temperatura, ecc.). Pertanto, le glicoproteine solitamente hanno eterogeneità nei modelli di glicosilazione, inclusi siti di glicosilazione, livelli di glicosilazione e la struttura specifica delle catene glicaniche, rendendo l'analisi della catena glicanica e il lavoro di caratterizzazione strutturale estremamente impegnativo. Per ottenere la massima quantità di informazioni strutturali sulla catena glicanica, la strategia principale dell'analisi della catena glicanica è quella di rilasciare prima le catene glicaniche dalle proteine e quindi eseguire un'analisi e una caratterizzazione dettagliate. In questa strategia, un metodo di deglicosilazione efficiente, accurato e stabile è fondamentale.
Attualmente per la deglicosilazione sono ampiamente utilizzati metodi enzimatici.
Le glicoproteine possono essere classificate in glicopeptidi N-linked e O-linked in base ai loro tipi di catene glicaniche. Per i glicopeptidi N-linked, gli enzimi comunemente usati includono la peptide N-glicosidasi F (PNGase F), l'endoglicosidasi H (Endo H) e l'endoglicosidasi S (Endo S). La PNGasi F idrolizza il legame GlcNAc-Asn e può rimuovere catene glicaniche ad alto contenuto di mannosio, complesse e ibride. L'Endo H scinde i legami glicosidici all'interno del nucleo pentasaccaridico della catena N-glicanica. L'Endo S scinde specificamente i glicani N-linked dal nucleo chitobiosio della catena pesante dell'IgG nativa.
Figura 1. Sito di taglio di PNGase F, Endo H ed Endo S.
Tra questi, PNGase F è il metodo enzimatico più efficace per rimuovere quasi tutti i composti N-legati oligosaccaridi in glicoproteine, che possono scindere glicoproteine oligosaccaridiche ad alto contenuto di mannosio, ibride e complesse collegate da asparagina, rimuovendo specificamente i glicani N-linked. Il sito di scissione è: il legame ammidico tra la N-acetilglucosamina (GlcNAc) più interna e il residuo di asparagina, convertendo al contempo l'asparagina sulla proteina dopo idrolisi enzimatica in acido aspartico.
Quando il fucosio α1-6 si trova nel nucleo del GlcNAc, anche la PNGasi F può tagliare; solo quando il fucosio α1-3 si trova nel nucleo del GlcNAc (comune nelle glicoproteine di piante e insetti), la PNGasi F non può tagliare.
Tuttavia, la reazione enzimatica convenzionale PNGase F richiede diverse ore per rilasciare gli N-glicani degli anticorpi e, a causa della preferenza per il rilascio di glicani, una deglicosilazione incompleta può portare a risultati distorti e la distribuzione di glicani ottenuta potrebbe non rappresentare la corretta composizione degli anticorpi terapeutici. Pertanto, ottenere un profilo N-glicano accurato il più rapidamente possibile è fondamentale per il monitoraggio della glicosilazione durante il processo di produzione di anticorpi e proteine di fusione di anticorpi e altri agenti bioterapeutici.
PNGase veloce F
Fast PNGase F è un reagente ricombinante ottimizzato che può rapidamente e completamente deglicosilare anticorpi, immunoglobuline, proteine di fusione e altre glicoproteine in pochi minuti. Questo enzima può rimuovere rapidamente e senza preferenze tutti gli N-glicani e può essere utilizzato direttamente per analisi cromatografiche o di spettrometria di massa a valle. Yeasen Fast PNGase F, N-glicosidasi F (versione veloce) semplifica il processo sperimentale, riducendo i tempi sperimentali e garantendo sensibilità e ripetibilità.
Caratteristiche del prodotto:
Veloce: Deglicosilazione completa e rapida in pochi minuti.
Elevata purezza: Nessuna contaminazione da proteasi e glicosidasi, purezza ≥95%.
Non selettivo: Rimuovere rapidamente e senza preferenze tutti gli N-glicani.
Buona compatibilità: Utilizzato direttamente per analisi cromatografiche o spettrometriche di massa a valle.
Dati di prova:
Deglicosilazione proteica in un unico passaggio:
- 10 ug di substrato/100 ug di anticorpo e ddH2O miscelati per un volume totale di 16 μL;
- Aggiungere 4 μL di tampone Fast PNGase F (5x), volume finale 20 μL;
- Aggiungere 1 μL di Fast PNGase F.
- Incubare a 50°C per 10 minuti.
Figura 2. Effetto della scissione enzimatica in un unico passaggio sul substrato proteico (A) e sull'anticorpo (B).
1: Marcatore proteicoCat#20350ES) 2: Competitore + substrato o anticorpo 3: Competitore + substrato o anticorpo 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrato o anticorpo 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Concorrente
Deglicosilazione proteica in due fasi:
- 10 ug di substrato/100 ug di anticorpo e ddH2O miscelati per un volume totale di 16 μL;
- Aggiungere 4 μL di tampone Fast PNGase F (5x), volume finale 20 μL;
- Incubare a 80°C per 2 minuti, raffreddare a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 μL di Fast PNGase F.
- Incubare a 50°C per 10 minuti.
Figura 3. Effetto di scissione enzimatica in due fasi sul substrato proteico (A) e sull'anticorpo (B).
1: Marcatore proteicoCat#20350ES) 2: Competitore + substrato o anticorpo 3: Competitore + substrato o anticorpo 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Substrato o anticorpo 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Concorrente
Conclusione:
- Yeasen Fast PNGase F ha un'efficienza di scissione enzimatica uguale o superiore a quella dei concorrenti importati nelle stesse condizioni di reazione;
- Si consiglia di eseguire una scissione enzimatica in due fasi per garantire una maggiore efficienza di scissione enzimatica. Alcuni anticorpi (come la Fab N-glicosilazione) richiedono una fase di preriscaldamento
per una deglicosilazione efficiente.
Inoltre, Yeasen fornisce anche la normale PNGase F (Cat#20407ES, attività specifica: 100000 U/mL) e altri tipi di glicosidasi, come Endo H glicosidasi H (Cat#20414ES), Endo S glicosidasi S (Cat#20413ES).
Guida all'acquisto
| Numero del prodotto | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Nome del prodotto | Veloce PNGasi F | PNGasi F | Endo H | Endo S |
| Fonte | Espressione ricombinante del lievito | Espressione ricombinante del lievito | Espressione ricombinante del lievito | Escherichia coli espressione ricombinante |
| Attività specifica | Non applicabile | 100000U/ml | 1000000U/ml | 8000 unità/mg |
| Sito di scissione | Quasi tutti i glicani N-legati | Quasi tutti i glicani N-legati | Glicani ad alto contenuto di mannosio N-linked | Scinde all'interno della struttura disaccaridica centrale della catena pesante dell'IgG |
| Tempo di digestione | 10 minuti | 1-3 ore | 1-3 ore | 1 ora |
| Glicosilazione | Adatto | Adatto | Adatto | Adatto |
| Struttura proteica | Adatto | Adatto | Adatto | Adatto |
Informazioni per l'ordinazione
| Nome del prodotto | Numero di prodotto | Specificazione |
| 20406ES20/50 | 20 tonnellate/50 tonnellate | |
| 20407ES01/02 | 15000 unità /75000 unità | |
| 20414ES92/97 | 10000 unità /50000 unità | |
| 20413ES80/90 | 1000 unità/5 x 1000 unità |