Quando si parla di telomeri e protelomerasi in biologia, la mente delle persone spesso pensa prima all'invecchiamento, un fenomeno naturale inevitabile. Telomeri È sequenze di DNA ripetitive alle estremità dei cromosomi eucariotici, che portano la responsabilità di mantenere l'integrità dei cromosomi e di regolare il ciclo di divisione cellulare.
Protelomerasi è un enzima di sintesi del DNA trascrittasi inversa che estende i telomeri. È una nucleoproteina composta da RNA e proteine. Il componente proteico può catalizzare la sintesi delle sequenze ripetute del telomero con la componente RNA.
Figura 1. Meccanismo di estensione del telomero mediata dalla protetelomerasi[1]
Protelomerasi può riparare e allungare i telomeri, compensare i difetti nella replicazione del DNA, prevenire la perdita dei telomeri durante la divisione cellulare e aumentare il numero di divisioni cellulari. Nel 2009, il premio Nobel per la fisiologia o la medicina è stato assegnato a Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider e Jack W Szostak per i loro eccezionali contributi nel rivelare il ruolo cruciale dei telomeri e della protelomerasi nella funzione cellulare e nell'invecchiamento.
Oggi voglio presentarvi una Protelomerasi unica: la TelN proProtelomerasi. TelN Protelomerasi proviene dal batteriofago N15 ed è un componente del sistema di replicazione N15, che partecipa nella generazione di DNA profago lineare. A differenza della protelomerasi negli eucarioti, TelN è un enzima proteico puro senza componenti di RNA. Ha scissione-legatura attività e lascia un'estremità covalentemente chiusa nel sito di scissione dopo aver tagliato il DNA a doppio filamento (dsDNA).
Figura 2. TelN Protelomerasi Sito di scissione
TelN Protelomerasi Meccanismo d'azione
Il sito di riconoscimento della TelN Protelomerasi è una sequenza palindroma lunga 56 bp, con telR e telL su entrambi i lati. La posizione centrale della sequenza target è anche una sequenza palindroma telO. TelN Protelomerasi si scinde all'interno della sequenza telO e forma una struttura a forcina chiusa covalentemente alle due estremità di scissione. L'estremità del DNA dopo la digestione è ancora composta da telR e telL, che è nota come osso di cane DNA (dbDNA).
Figura 3. Protelomerasi meccanismo di scissione nel sito TelN[2]
Grazie alla speciale attività di scissione-legatura enzimatica della TelN Protelomerasi, il DNA plasmidico circolare può essere convertito in molecole lineari chiuse covalentemente a forma di manubrio tramite una reazione enzimatica in un unico passaggio. Rispetto alle molecole di DNA lineari aperte, il DNA lineare chiuso ha un livello di espressione proteica più elevato nelle cellule, il che è molto adatto per costruire mini DNA lineari a estremità chiusa con elevata stabilità e minima sequenza estranea. Il DNA plasmidico svolge un ruolo fondamentale come elemento centrale del vaccino mRNA, del vaccino DNA e della terapia genica cellulare. Il tradizionale metodo di produzione del plasmide prevede la fermentazione con Escherichia coli e amplificazione multi-stadio, e il rischio incontrollabile nel processo di fermentazione limita la resa di plasmide di alta qualità, che diventa la chiave per limitare la capacità di produzione di vaccini. La società Touchlight nel Regno Unito ha lanciato un'innovativa tecnologia dbDNA. Questa tecnologia interrompe il metodo tradizionale di fermentazione batterica per la preparazione del DNA plasmidico e invece di utilizzare la sintesi enzimatica in vitro del DNA. La speciale attività di scissione-legatura enzimatica della TelN Protelomerasi viene anche impiegata per generare mini DNA lineare a estremità chiusa nel metodo di cui sopra.
Applicazione della TelN Protelomerasi nella sintesi enzimatica del DNA
Il metodo enzimatico in vitro del DNA basato sulla DNA polimerasi phi29 e sulla protelomerasi TelN può evitare molti rischi incontrollabili nel processo di fermentazione biologica e il metodo enzimatico in vitro può sintetizzare il DNA con velocità elevata e resa elevata. Il DNA sintetizzato può essere utilizzato in molte tecnologie emergenti, come il vaccino mRNA, il vaccino DNA, il vettore di terapia genica e l'editing genico.
Figura 4. Diagramma di flusso della sintesi enzimatica del DNA[3]
Processo di sintesi enzimatica del DNA
- Denaturazione del modello
Il modello di DNA plasmidico circolare viene convertito in due DNA circolari a singolo filamento mediante un processo di denaturazione.
- Amplificazione del cerchio rotante
L'amplificazione a cerchio rotante è stata effettuata utilizzando la DNA polimerasi Phi29 e il DNA circolare a singolo filamento per generare un lungo DNA concatemerico lineare a doppio filamento con intervalli di sequenza di riconoscimento della protelomerasi.
- Taglio e chiusura covalente
La proteolomerasi TelN riconosce il telRL sul DNA dei complessi telomerici ed esegue attività di scissione-legatura per generare monomeri di DNA lineari, connessi covalentemente.
- Rimozione del DNA batterico
Le endonucleasi di restrizione o esonucleasi degradano il DNA scheletrico dei batteri con una struttura aperta all'estremità per ottenere DNA contenente solo gli elementi di espressione genica target. La sintesi enzimatica della tecnologia del DNA bypassa la fermentazione biologica e può raggiungere rapidamente la sintesi del DNA plasmidico a livello GMP, risolvendo le limitazioni della capacità produttiva nei campi della terapia genica e dei vaccini mRNA. Ha un enorme potenziale per l'industrializzazione. Per promuovere lo sviluppo della tecnologia di sintesi enzimatica del DNA, YEASEN Biology può fornire materiali enzimatici di base per la sintesi enzimatica del DNA, come la DNA polimerasi phi29 (14404ES) e la protelomerasi TelN (14540ES), per assistere nella ricerca e nella produzione della tecnologia di sintesi enzimatica del DNA.
Ppresentazione delle prestazioni di YEASEN TelN Protelomerasi
- Le prestazioni di scissione e legatura sono eccellenti, equivalenti a quelle dei marchi importati.
Utilizzando un plasmide superavvolto contenente il sito di riconoscimento TelN Protelomerase come stampo, è stato aggiunto l'enzima di addizione a gradiente (0,078-5 U) da YEASEN e il marchio A. 0,5 μg di plasmide superavvolto sono stati convertiti in DNA a doppio filamento lineare chiuso (dsDNA). È stata utilizzata l'elettroforesi su gel per rilevare l'efficienza di conversione e i risultati hanno mostrato che l'attività di scissione e legatura della TelN Protelomerase di YEASEN era equivalente a quella del marchio A.
Figura 5. Rilevamento dell'attività di scissione della protelomerasi di TelN M:Marker, C: controllo del plasmide superavvolto
- L'integrità di chiusura del dsDNA lineare > 90%
Utilizzando il plasmide superavvolto contenente il sito di riconoscimento TelN Protelomerase come stampo, aggiungendo TelN Protelomerase di YEASEN e brand A, convertendo 0,5 μg di plasmide superavvolto in dsDNA lineare chiuso e aggiungendo T5 esonucleasi per rilevare la sua integrità terminale tramite il grado di degradazione della banda. I risultati hanno mostrato che l'integrità della chiusura terminale del dsDNA generata da TleN Protelomerase di YEASEN era > 90%, il che era equivalente a quella del brand A.
Figura 6. Test di integrità della chiusura terminale della TelN Protelomerasi. C1: plasmide contenente il sito di riconoscimento TelN, senza TelN Protelomerasi; C2: plasmide contenente il sito di riconoscimento TelN, TelN Protelomerasi, senza T5 esonucleasi; Plasmide: plasmide contenente il sito di riconoscimento TelN.
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| Classificazione del prodotto | Nome del prodotto | Numero di catalogo |
| Protelomerasi | 14540ES | |
| DNA polimerasi Phi29 | 14404ES | |
| Esonucleasi | Esonucleasi III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rriferimenti
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomeri e protelomerasi biologia. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Il mini DNA lineare chiuso generato dall'enzima di scissione-unione procariotico TelN è funzionale nelle cellule dei mammiferi. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Il mini DNA lineare chiuso generato dall'enzima di scissione-unione procariotico TelN è funzionale nelle cellule dei mammiferi. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.