Endonucleasi di restrizione della serie Yeasen FuniCut™, digestione in 5 minuti con tampone universale
La clonazione molecolare è utilizzata in quasi tutti i laboratori. Le endonucleasi di restrizione sono una componente cruciale negli esperimenti di clonazione molecolare, ma le persone sono spesso infastidite anche da vari problemi con gli esperimenti con endonucleasi di restrizione. I problemi comuni sono i seguenti:
- Esistono così tanti tipi di endonucleasi di restrizione che è difficile scegliere.
- Scissione errata, scissione casuale o scissione enzimatica incompleta.
- La digestione è lenta: può durare un'ora o addirittura tutta la notte.
- Inoltre, gli esperimenti di digestione enzimatica multipla devono anche scegliere una varietà di digestione enzimatica bTo
Per dimostrare con ide una comprensione più approfondita delle endonucleasi di restrizione, quanto segue spiegherà brevemente cosa sono le endonucleasi di restrizione e come vengono classificate le varie endonucleasi in risposta alla prima domanda. La serie Yeasen FuniCut™ di Fast Restriction Endonucleases può facilmente risolvere il secondo, il secondo e il quarto problema tramite modulazione della deformazione e una procedura migliorata!
1. Che cosa sono le endonucleasi di restrizione?
2. Restrizioni nomenclatura endonucleasi
3. Restrizioni sulla classificazione delle endonucleasi
4. Endonucleasi a restrizione rapida Yeasen FuniCut™
1. Che cosa sono le endonucleasi di restrizione?
Le endonucleasi di restrizione sono una classe di enzimi in grado di riconoscere sequenze nucleotidiche specifiche nelle molecole di DNA a doppio filamento e di tagliare il legame fosfodiesterico nelle catene di DNA in siti specifici.
Diverse endonucleasi di restrizione riconosceranno diverse sequenze di DNA. Possono tagliare il DNA all'interno della sequenza di riconoscimento o in un punto non lontano dalla sequenza di riconoscimento, dando origine a vari prodotti, come illustrato nella Figura 1. BamHI forma estremità appiccicose, KpnI forma estremità 3'ticky e EcoRV forma estremità smussate.
Figura 1. Diagramma schematico della digestione BamHI, KpnI, EcoRV
2. Restrizioni nomenclatura endonucleasi
Il nome del genere, il nome della specie, il ceppo batterico o il sierotipo e l'ordine di scoperta sono i fattori principali utilizzati per denominare le endonucleasi di restrizione. Le linee guida per i nomi sono visualizzate nella Tabella 1 di seguito, utilizzando BstEII come esempio:
Tabella 1. Restrizioni nomenclatura endonucleasi
| Abbreviazione | Nome e cognome | Implicazione |
| B | Bacillo | Prima lettera del nome del genere |
| santo | Stearotermofilo | Le prime due lettere del nome della specie |
| E | E | La prima lettera del nome del ceppo |
| Io sono | Seconda scoperta | L'ordine riscontrato in tali batteri |
3.Restrizioni sulla classificazione dell'endonucleasi
In base alla complessità della struttura, alla modalità di azione e alla differenza tra i cofattori, gli enzimi di restrizione possono essere suddivisi in quattro categorie. La seguente tabella 2 riassume le caratteristiche e gli enzimi tipici di ciascuna categoria.
Tabella 2. Le variazioni tra diverse endonucleasi di restrizione
| Classe endonucleasi | Caratteristiche | Specie enzimatiche tipiche |
| Tipo I | 1. Riconoscimento e modificazione della scissione. 2. Può riconoscere sequenze specifiche di DNA e il sito di digestione è indefinitamente lontano dal sito di riconoscimento, fino a migliaia di basi. 3. L'azione necessita di ATP. | EcoB, EcoK, ecc. |
| Tipo II | 1. Ha solo la funzione di identificare il taglio. 2. La sequenza di riconoscimento è spesso una breve sequenza palindromica (circa 4–8 bp) e il sito di digestione specifico dell'endonucleasi di restrizione è in genere la sequenza riconosciuta. 3. L'azione necessita di Mg2+. 4. Il tipo di enzimi di restrizione più frequentemente utilizzati nella clonazione molecolare. | HindIII, NotI, ecc. |
| Tipo III | 1. Riconoscimento e modifica della digestione. 2. Aboutseparatesp separa il sito di riconoscimento dal sito di digestione. 3. L'azione necessita di ATP. | HinfIII et al. |
| Tipo IV | 1. Taglia solo le sequenze di DNA metilate. 2. Circa 30 bp separano il sito di riconoscimento dal sito di digestione. | McrA, McrBC, ecc. |
Come indicato nella Tabella 3 sottostante, è possibile suddividerlo in tre gruppi in base alle somiglianze e alle differenze tra i siti di riconoscimento e digestione.
Tabella 3.Analisi comparativa di Isoschizomero, Neoschizomero e Isocaudarner
|
| Isoschizomero | Neoschizomero | Isocaudarno |
| sequenza di riconoscimento | Stesso | Stesso | diverso |
| siti di digestione | Stesso | diverso | Stesso |
| tipico rappresentante | AgeI e BshTI: entrambi riconoscono e scindono 5′-A↓CCGGT-3′ | SmaI (5′-CCC↓GGG-3′) e XmaI(5′-C↓CCGGG-3′) | BamHI (5'-G↓GATCC-3') e BglII (5'-A↓GATCT-3') |
Considerando che alcune endonucleasi di restrizione presenti sul mercato richiedono ancora una digestione notturna e i prodotti sono soggetti a una digestione errata, la nucleasi Yeasen Fast Restriction Endoa, un tampone universale, completa la digestione accurata in 5 minuti, evitando così che i tuoi esperimenti di digestione diventino più un problema!
4. Yeasen FuniCut™ Endonucleasi di restrizione rapida
Figura 2. Endonucleasi a restrizione rapida Yeasen FuniCut™
4.1 Caratteristiche
- Digestione rapida: la digestione può essere completata in 5-15 minuti, il che può essere ridotto di oltre 1-2 ore rispetto agli esperimenti di digestione convenzionali.
- Tampone universale: la reazione di scissione multienzimatica è semplificata dal fatto che qualsiasi combinazione di endonucleasi può utilizzare lo stesso tampone.
- Effetto della digestione enzimatica: paragonabile a N* e appropriato per il suo tampone.
- L'elettroforesi diretta semplifica il processo poiché fornisce un tampone di colore rosso e consente ai prodotti della digestione di essere trasportati direttamente per l'elettroforesi.
- Digestione precisa: anche con la digestione notturna, l'attività stellare è molto ridotta.
4.2 Esibizione della performance
4.2.1 Nel FuniCut™ Buffer, la digestione singola, doppia e tripla avviene in 5 minuti.
Figura 3. Digestione singola, doppia e tripla utilizzando FuniCut™ Il tampone può essere solitamente completato in 5 minuti, ad esempio con la tripla digestione utilizzando EcoRI+KpnI+SmaI.
4.2.2 L'impatto della digestione enzimatica è paragonabile a quello di N* e T* e funziona bene con i loro tamponi.
Figura 4. Rispetto a prodotti simili N*, T*, l'effetto di digestione enzimatica di Yeasen FuniCut™ BamHI è compatibile con i tamponi del marchio N*, T*.
4.2.3 Digestione notturna con attività stellare molto bassa
Figura 5. Utilizzare le endonucleasi rapide HindIII, NheI, PstI, XbaI e XhoI di Yeasen, Tbydance con il protocollo sperimentale consigliato da ciascun marchio.Eseguire una digestione notturna (16 ore) e analizzare i prodotti digeriti mediante elettroforesi su gel di agarosio.
4.2.4 Altamente ridondante e in grado di gestire una parte del substrato in eccesso.
Figura 6. Utilizzando le endonucleasi di restrizione rapida FuniCut™ EcoR I, Eag I, XbaI e Sac I, sono stati utilizzati rispettivamente 1 μg e 1,5 μg di plasmide come substrati e digeriti per 5 minuti, e i prodotti digeriti sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio.
Tabella 4.Prodotti e compatibilità del tampone di reazione
| Nome del prodotto | Gatto# | Sequenza di riconoscimento | Temperatura | Temperatura di disattivazione termica |
| T* Tampone | N* Tampone | Tampone Ta* | Base protetta (bp) | Risposte |
| Dispositivo FuniCut™ AscI (informarsi) | 15001ES50 | GG/CGCGCC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| Dispositivo FuniCut™ AvrII (informarsi) | 15002ES25 | C/CTAGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ BamHI (informarsi) | 15003ES76 | G/GATCC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 500T |
| Trattamento FuniCut™ BclI (informarsi) | 15004ES62 | T/GATCA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 125T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ BsaI (informarsi) | 15005ES50 | GGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | Non | 50T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ BstEII (informarsi) | 15006ES60 | G/GTNACC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | Non | 100T |
| Dispositivo FuniCut™ ClaI (informarsi) | 15007ES50 | AT/CGAT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ DpnII (informarsi) | 15008ES50 | /GATC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | Non | 50T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ EagI (informarsi) | 15009ES25 | C/GGCCG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ EcoRI (informarsi) | 15010ES78 | G/AATTC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 600T |
| FuniCut™ EcoRV (informarsi) | 15011ES70 | GAT/ATC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 200T |
| FuniCut™ HindIII (informarsi) | 15012ES76 | A/AGCTT | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 500T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ HpaI (informarsi) | 15013ES50 | GTT/CAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 1 | 50T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ KpnI (informarsi) | 15015ES70 | GGTAC/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 200T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ MluI (informarsi) | 15016ES60 | A/CGCGT | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 100T |
| Dispositivo di protezione FuniCut™ NcoI (informarsi) | 15018ES30 | C/CATGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™informarsi) | 15019ES70 | CA/TATG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ NheI (informarsi) | 15020ES30 | G/CTAGC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30T |
| FuniCut™ NonI (informarsi) | 15021ES50 | GC/GGCCGC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| Dispositivo FuniCut™ PstI (informarsi) | 15022ES76 | CTGCA/G | 37 | NO | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 500T |
| Sacchetto FuniCut™ (informarsi) | 15023ES60 | GAGCT/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 100T |
| FuniCut™ SalI (informarsi) | 15024ES70 | G/TCGAC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200T |
| Dispositivo FuniCut™ SbfI (informarsi) | 15025ES25 | CCTGCA/GG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ Piccolo (informarsi) | 15027ES60 | CCC/GGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100T |
| Gioco FuniCut™ (informarsi) | 15028ES50 | A/CTAGT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| Dispositivo FuniCut™ SphI (informarsi) | 15029ES50 | GCATG/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| Dispositivo FuniCut™ SspI (informarsi) | 15030ES56 | AAT/ATT | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 60T |
| Dispositivo FuniCut™ StuI (informarsi) | 15031ES60 | AGG/CCT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ TaqI (informarsi) | 15032ES70 | T/CGA | 65 | NO | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| Dispositivo FuniCut™ XbaI (informarsi) | 15033ES76 | T/CTAGA | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 500T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ XhoI (informarsi) | 15034ES76 | C/TCGAG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 500T |
| Dispositivo FuniCut™ FspI (informarsi) | 15036ES50 | TGC/GCA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 50T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™informarsi) | 15038ES76 | G/ANTC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 500T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ ApaLI (informarsi) | 15039ES70 | G/TGCAC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ NruI (informarsi) | 15040ES50 | TCG/CGA | 37 | NO | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 50T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ PacI (informarsi) | 15041ES25 | TTAAT/TAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ PvuII (informarsi) | 15042ES70 | CAG/CTG | 37 | NO | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| Dispositivo FuniCut™ SacII (informarsi) | 15043ES50 | CCGC/GG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| Dispositivo FuniCut™ NsiI (informarsi) | 15044ES25 | ATGCA/T | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25T |
| Dispositivo FuniCut™ Esp3I (BsmBI) (informarsi) | 15048ES30 | CGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 30T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ BglII (informarsi) | 15049ES60 | A/GATC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 100T |
| Dispositivo di taglio FuniCut™ BstBI (informarsi) | 15050ES60 | TT/CGAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | Non | 100T |
| Dispositivo FuniCut™ MnlI (informarsi) | 15051ES50 | CCTC(7/6) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
CpG: influenzato dalla metilazione CpG.
EK: influenzato dalla metilazione EcoKI.
EB: interessato dalla metilazione EcoBI.
Dcm: interessato dalla metilazione Dcm.
Dam: interessato dalla metilazione della Dam.