- Sfondo
I dati riassunti in questo rapporto sono stati elaborati da Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. per MycAwayTM Kit di rilevamento qPCR in tempo reale del micoplasma (2G) prodotto.
I dati riassuntivi sono solo per riferimento dell'utente, e l'utente deve verificare il metodo del micoplasma utilizzando i propri campioni per confermare che il metodo può soddisfare i requisiti dell'utente. Si raccomanda a tutti i laboratori che utilizzano questo kit di verificare i seguenti parametri: limite di rilevamento, specificità e robustezza.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. può fornire il report di qualificazione dettagliato per questo kit. Se l'utente utilizza questo report, allora solo l'idoneità (che include il limite di rilevamento e la specificità) deve essere verificata.
Contenuto di convalida:
| Prestazione | Parametri di convalida | Risultati di convalida |
| Limite di rilevamento | Limite di rilevamento del ceppo di Mycoplasma | Limite di rilevamento per 10 tipi di micoplasmi farmacopeici: 10 CFU/mL, ciascuno testato 24 volte con un tasso di rilevamento ≥95%. |
| Specificità | Interferenza della matrice campione | Sono state testate 9 diverse matrici di campioni e soluzioni di diluizione del DNA, senza rilevare alcun micoplasma. |
| Reattività crociata | Sono stati testati 14 ceppi e 6 cellule ingegnerizzate comunemente utilizzate nei prodotti biofarmaceutici, senza rilevare alcun micoplasma. | |
| Durata | Stabilità al congelamento e allo scongelamento | Può resistere a 20 cicli ripetuti di congelamento-scongelamento senza compromettere le prestazioni del kit. |
| Stabilità dell'accelerazione termica | Inalterato in condizioni di 37°C per 14 giorni e 4°C per 30 giorni. | |
| Compatibilità dello strumento | Compatibile con ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 e Roche LightCycler®480. | |
| Copertura | Copertura dei tipi di DNA del micoplasma | Il confronto dei database utilizzando le sequenze 16S rRNA del micoplasma copre 183 specie all'interno della classe Mollicutes. |
- Materiali e metodi sperimentali
2.1 Il mio vialeTM Kit di rilevamento qPCR in tempo reale del micoplasma (2G), fornitore: Yeasen, n. cat.: 40619ES60.
2.2 MolPureTM Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico, fornitore: Yeasen, n. cat.: 18461ES60.
2.3 Gli standard di sensibilità al micoplasma vengono acquistati da Minerva Biolabs (MB), i cui ceppi provengono dalla National Collection of Type Cultures (NCTC). Gli standard di sensibilità sono micoplasmi inattivati e utilizzati per la verifica metodologica del metodo di amplificazione dell'acido nucleico (metodo qPCR/PCR) per il rilevamento del micoplasma. Vengono acquistati in totale 10 tipi di micoplasmi che includono i requisiti di EP 2.6.7 e JP G3. Le informazioni degli standard sono le seguenti:
| Venditore | Numero di gatto. | Numero NCTC. | ATCC NO. | Nome del materiale |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10CFU™ Standard di sensibilità Mycoplasma arginino |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10CFU™ Standard di sensibilità Mycoplasma orale | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10CFU™ Standard di sensibilità Micoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10CFU™ Standard di sensibilità Micoplasma pneumoniae | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10CFU™ Standard di sensibilità Mycoplasma sinoviale | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10CFU™ Standard di sensibilità Mycoplasma fermentano | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10CFU™ Standard di sensibilità Micoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10CFU™ Standard di sensibilità Acholeplasma laida | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ Standard di sensibilità Spiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10CFU™ Standard di sensibilità Micoplasma salivario |
2.4 Dati originali: la versione elettronica è stata registrata nel 'Rapporto sperimentale' il sottofile del file padre 'MycAwayTM Kit di rilevamento qPCR in tempo reale del micoplasma (2G).
2.5 Metodi: I materiali e i metodi operativi utilizzati per l'esperimento sono stati fondamentalmente prodotti o stabiliti da Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., che sono stati valutati e verificati a lungo; lo sviluppo e la produzione del kit hanno seguito il sistema ISO 13485.
- Contenuti e risultati della qualificazione
3.1 Limite di rilevamento (LOD)
L'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento del ceppo standard di Mycoplasma da 10 CFU/mL sono stati eseguiti secondo le istruzioni per il ceppo standard e le istruzioni per il kit di estrazione e rilevamento. Sono stati ottenuti 24 test totali per il ceppo standard di Mycoplasma da 10 CFU/mL. I campioni NCS (Negative Control Sample) e NTC (No Template Control) sono stati testati simultaneamente in ogni esperimento.
I risultati hanno mostrato che i risultati NCS e NTC erano soddisfacenti e tutti i 24 campioni da 10 CFU/mL sono risultati positivi, soddisfacendo il requisito di avere almeno 23 risultati positivi su 24 test.
| NO. | Nome del materiale | Concentrazione del liquido batterico |
| 1 | Mycoplasma arginino | 10 UFC/mL |
| 2 | Mycoplasma orale | 10 UFC/mL |
| 3 | Micoplasma gallisepticum | 10 UFC/mL |
| 4 | Micoplasma pneumoniae | 10 UFC/mL |
| 5 | Mycoplasma sinoviale | 10 UFC/mL |
| 6 | Mycoplasma fermentano | 10 UFC/mL |
| 7 | Micoplasma hyorhinis | 10 UFC/mL |
| 8 | Acoleplasma Laylawii | 10 UFC/mL |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 UFC/mL |
| 10 | Micoplasma salivario | 10 UFC/mL |
Tabella 1 Informazioni sui ceppi convalidati
| 10 UFC/mL | Esperimento 1 | Esperimento 2 | Esperimento 3 |
| Tasso di rilevamento | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Totale | 24/24 | ||
Tabella 2 Risultati del limite di rilevamento
3.2 Specificità
3.2.1 Intervallo di test del micoplasma
Le sequenze della sonda primer nel kit sono state confrontate con il genoma dell'rRNA 16S nel database. Attraverso l'analisi bioinformatica, è stato ottenuto che il MycAwayTM Il kit di rilevamento Mycoplasma qPCR (metodo di prova) di NextSense Biologicals può coprire almeno 183 specie di Zooxantelle, tra cui 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma e 7 Cholestrongyla, e così via.
3.2.2 Interferenza della matrice campione
9 substrati (MEM di Dulbecco, terreno di coltura F-10 di Ham, terreno di coltura M-199, terreno di coltura F-12K di Ham, terreno di coltura RPMI-1640, terreno di coltura 5A di McCoy, terreno di coltura F-12K di Ham+1,0 mM/L di glutammina, terreno di coltura LEIBOVITZ MEDTA +2,0 mM/L di L-15.Per verificare l'interferenza della matrice del campione vengono utilizzati come campioni 05 mM di L-Glutammina e DMEM (mezzo standard a basso contenuto di glucosio); i risultati hanno mostrato che il mezzo non interferisce con i reagenti del kit.
3.2.3 Intervallo di rilevamento dei Flexibacteria
È richiesta l'estrazione e la rilevazione del micoplasma inattivato (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) a 10 CFU/mL, insieme ai test sui campioni NCS e NTC.
I risultati hanno mostrato che NCS e NTC non sono stati rilevati e i risultati sono stati negativi; sono state rilevate tutte e 10 le specie di micoplasma e i risultati sono stati positivi.
3.2.4 Reazione incrociata
Per 14 ceppi non flexibatterici tra cui Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), un certo numero di altri comuni microrganismi bacillo-cocco-fungo (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis e Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) e sei cellule ingegnerizzate (HEK293, 293T, Vero, CHO, E. coli, SF9) sono state utilizzate per il rilevamento del micoplasma utilizzando il MolPureTM Metodo con perline magnetiche per il kit di pre-elaborazione del campione di DNA residuo (flaconi) e MycAwayTM Kit di rilevamento qPCR del micoplasma (metodo sonda) (2G) e ciascun esperimento è stato eseguito simultaneamente con i test sui campioni PCS, NCS e NTC.
I risultati hanno mostrato che i risultati di PCS, NCS e NTC erano soddisfacenti; i campioni di prova erano negativi e non si è verificata alcuna reattività crociata.
3.3 Robustezza
3.3.1 Stabilità al gelo e allo scongelamento
Il kit per il test del Mycoplasma è stato sottoposto a esperimenti di congelamento-scongelamento in condizioni di -25℃~-15℃ e i risultati hanno mostrato che il kit è stato in grado di resistere a 20 cicli di congelamento e scongelamento ripetuti, senza che le sue prestazioni ne siano state compromesse.
3.3.2 Stabilità accelerata
Il kit di rilevamento del Mycoplasma è stato sottoposto a accelerazione termica a 37℃ per 14 giorni e a 4℃ per 30 giorni, rispettivamente, e i risultati hanno mostrato che le prestazioni del prodotto non sono state influenzate.
3.3.3 Applicabilità dello strumento
Per il kit di rilevamento del micoplasma, sono state utilizzate diverse concentrazioni di controllo positivo e DNA di Mycoplasma pneumoniae nel kit come campioni da testare e gli esperimenti sono stati eseguiti su quattro marche e modelli diversi, vale a dire, rispettivamente, Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S e Roche LightCycler®480.Gli esperimenti sono stati eseguiti sugli strumenti qPCR di quattro marche e modelli diversi: Shanghai Hongshi SLAN-96S e Roche LightCycler®480.
I risultati hanno mostrato che i campioni da testare sono stati rilevati su strumenti qPCR di modelli di diversi produttori e che i risultati del controllo negativo sono stati qualificati, senza che le prestazioni del kit ne fossero influenzate.
- 4.Riferimento
4.1 Metodo di esame del micoplasma <3301>. Farmacopea cinese, parte III [S]. Pechino: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Linee guida per la convalida dei metodi analitici <9101>. Farmacopea cinese, parte III [S]. Pechino: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Linee guida per la convalida di metodi alternativi per i test microbiologici dei prodotti farmaceutici <9201>. Farmacopea cinese, parte III [S]. Pechino: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Micoplasmi. Farmacopea Europea[S]. 10a edizione, 2020: Sezione 2.6.7, 194-199.
4.5 Test del micoplasma per substrati cellulari utilizzati per la produzione di prodotti biotecnologici/biologici <G3-14-170>. Farmacopea giapponese[S]. 18a edizione, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham, et al. Impatti sugli attributi di qualità del prodotto di anticorpi monoclonali prodotti in colture di bioreattori cellulari CHO durante eventi di contaminazione intenzionale da micoplasma. Biotecnologia e bioingegneria. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Test del micoplasma su substrati cellulari e biologici: revisione di tecniche alternative non microbiologiche. Mol Cell Probes. 2011 apr-giu;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Un metodo di rilevamento PCR per testare la contaminazione da Mycoplasma di vaccini veterinari e prodotti biologici. Lett in Applied Microbiology. 2015 febbraio;60(2):174-180.
Informazioni per l'ordinazione
| Descrizione | Numero di parte |
| Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico MolPure® | 18461ES |
| Kit di rilevamento qPCR MycAway™ Mycoplasma (2G) | 40619ES |