CHO Kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti (3G)
Riepilogo delle qualifiche (n. cat.: 41332(ES60)
- Sfondo
I dati riassunti in questo rapporto sono stati eseguiti da Yeasen Biotechnology per CHO Prodotto Host Cell DNA Residue Detection Kit (3G). I dati riepilogativi sono solo per riferimento dell'utente, e l'utente deve verificare il residuo della cellula ospite Metodo del DNA utilizzando i propri campioni per confermare che il metodo può soddisfare i requisiti dell'utente. Si raccomanda a tutti i laboratori che utilizzano questo kit di verificare i seguenti parametri: Linearità, Range, Accuratezza, Precisione, Limite di quantificazione, Specificità e Robustezza.
Yeasen Biotechnology può fornire il report di qualificazione dettagliato per questo kit. Se l'utente utilizza questo report, solo l'idoneità (che includeva Precisione, Precisione e Specificità) devono essere verificate.
- Materiali e metodi sperimentali
2.1 CHO Kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti (3G), fornitore: Yeasen, n. cat.: 41332ES60.
2.2 Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico MolPure, fornitore: Yeasen, n. cat.: 18461ES60.
2.3 Dati originali: la versione elettronica è stata registrata nel 'Rapporto sperimentale' il sottofile del file padre CHO Kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti (3G).
2.4 Metodi: I materiali e i metodi operativi utilizzati per l'esperimento sono stati fondamentalmente prodotti o stabiliti da Yeasen Biotechnology, valutati e verificati a lungo; lo sviluppo e la produzione del kit hanno seguito il sistema ISO 13485.
- Contenuti e risultati della qualificazione
3.1 Campo di rilevamento
L'intervallo lineare del kit era 3 fg/μL~300 pg/μL con R2=1 e l'efficienza di amplificazione è stata del 99,09% con CV<15% per ogni analisi di concentrazione.
Figura 1 Curva standard qPCR del DNA CHO (3G)
3.2 Precisione
3.2.1 Rrecupero
3.2.1.1 Esperimento di recupero del picco del campione vuoto
Campioni di CHO Standard di DNA ad alte e basse concentrazioni: 30 pg/μl, 300 fg/μL e 3 fg/μL sono stati preparati, rispettivamente, e analizzati dopo l'estrazione utilizzando il metodo Magnetic Bead per il kit di pretrattamento del campione di DNA residuo (3 sono state eseguite repliche di estrazione per ciascun campione e sono state eseguite 3 repliche di analisi per ciascuna estrazione), e sono stati analizzati i recuperi dei campioni e i CV.
Per diverse concentrazioni di campioni di DNA, i recuperi variavano dal 70% al 130% e i CV erano tutti <20%.
| Tipo di campione | Concentrazione teorica | Estrarre 1 media | Estrarre 2 significa | Estrarre 3 significa | Concentrazione media | Curriculum Vitae | Recupero |
| Campione vuoto | / | / | / |
| / | / | / |
| Campione di recupero 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27.51 | 28.27 | 27.62 | 2,20% | 92,06% |
| Campione di recupero 2 | 300 fg/μl | 285,53 | 301,25 | 295,71 | 294.16 | 2,71% | 98,05% |
| Campione di recupero 3 | 3 fg/μL | 3.50 | 3.54 | 3.31 | 3.45 | 3,56% | 115,00% |
Tabella 1 Recupero del campione vuoto Spiking
3.2.1.2 Esperimento di recupero del picco del campione simulato
Sono stati estratti campioni della stessa concentrazione (300 fg/μL di DNA CHO) (sono state eseguite 3 repliche di estrazione per ciascun campione e 3 repliche di analisi per ciascuna estrazione) con 5 diverse soluzioni di base (alto contenuto proteico, alto contenuto di acidi nucleici, alto e basso pH, alto contenuto di sale) e sono stati analizzati i recuperi dei campioni e i CV.
I recuperi dei campioni di DNA per diverse soluzioni di base variavano dal 70% al 130%, con tutti i CV <20%.
| Tipo di campione | Concentrazione teorica | Estrarre 1 media | Estrarre 2 significa | Estrarre 3 significa | Concentrazione media | Curriculum Vitae | Recupero |
| Esempio di base | / | / | / |
| / | / | / |
| Alto contenuto proteico | 300 fg/μL | 302.29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47% | 108,66% |
| Acido nucleare alto | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28% | 98,21% | |
| Ad alto contenuto di sale | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00% | 96.90% | |
| pH elevato | 296.04 | 320,58 | 324,56 | 313.72 | 4,92% | 104,57% | |
| pH basso | 314,77 | 327,89 | 340,26 | 327,64 | 3,89% | 109,21% |
Tabella 2 Recupero del campione di base Spiking
3.3 Precision
3.3.1 Ripetibilità
Ripetere il test 10 volte per gli standard di DNA CHO a una concentrazione di 3 fg/μL con un CV <15%.
| Ripetizioni | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significare | %di CV |
| Valore di rilevamento (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2.89 | 3.16 | 2,95 | 2.87 | 2.88 | 2,75 | 2.87 | 3.15 | 2,99 € | 5,65% |
Tabella 3 Risultati di ripetibilità
3.3.2 Precisione intermedia
Tre sperimentatori hanno testato in modo indipendente campioni standard di DNA CHO ad alte e basse concentrazioni: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 3 fg/μL; sono state eseguite tre repliche per ciascuna concentrazione e i CV di tutti i nove dati ottenuti erano <15%.
| Esp |
Concentrazione effettiva Concentrazione teorica | DNA CHO (3G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/ul | 3 fg/ul | ||
| Esp 1 | Determinazione 1 | 302.63 | 2.97 | 3.40 |
| Determinazione 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Determinazione 3 | 287,67 | 2,99 € | 3.01 | |
| Esp2 | Determinazione 4 | 292,27 | 2.92 | 3.47 |
| Determinazione 5 | 299,61 | 2,90 | 2.82 | |
| Determinazione 6 | 305.73 | 2.93 | 2,90 | |
| Esp 3 | Determinazione 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Determinazione 8 | 299.17 | 3.00 | 3.21 | |
| Determinazione 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Significare | 297.04 | 2,98 | 3.13 |
| / | %di CV | 2.03 | 2,80 | 6,85 |
Tabella 4 Risultati di precisione intermedia
3.4 Specificità
L'interferenza del DNA genomico cellulare comunemente utilizzato nella produzione di prodotti biologici è stata valutata per l'interferenza con i reagenti di rilevamento del DNA CHO; il gruppo di interferenza si è sovrapposto al gruppo di controllo e non è stata osservata alcuna interferenza (la figura seguente mostra, in ordine, i dati di interferenza dei DNA genomici di topo, MDCK, HEK293 ed E. coli con i reagenti di rilevamento del DNA CHO).
Figura 2 Risultati dell'esperimento di interferenza
3.5 Limite di quantificazione
Il DNA CHO è stato rilevato a 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3 fg/uL e 0,1 fg/μL, con 10 repliche per ciascuna concentrazione. I risultati hanno mostrato che il CV era <20% a concentrazioni di 0,3 fg/μL e superiori. Vale a dire, il limite di quantificazione del kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti CHO (3G) era 0,3 fg/μL.
|
Ripetizioni Elemento di prova | DNA CHO (3G) (fg/μL) | |
| Quantità | Rapporto di ricalcolo% | |
| 1 | 0,28 | 93,33% |
| 2 | 0,26 | 86,67% |
| 3 | 0,32 | 106,67% |
| 4 | 0,30 | 100,00% |
| 5 | 0,33 | 110,00% |
| 6 | 0,23 | 76,67% |
| 7 | 0,29 | 96,67% |
| 8 | 0,37 | 123,33% |
| 9 | 0,31 | 103.33% |
| 10 | 0,28 | 93,33% |
| Significare | 0,30 | / |
| %di CV | 13,09% | / |
Figura 3. Risultato del test qPCR del DNA CHO (3G)
3.6 Limite di rilevamento
Il DNA CHO è stato rilevato a 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL e 0,01 fg/μL, con 20 repliche per ciascuna concentrazione. I risultati hanno mostrato che il tasso di rilevamento era ≥19 (vale a dire, tasso di rilevamento ≥95%) in 20 pozzetti replicati a concentrazioni di 0,05 fg/μL e superiori. Vale a dire, il limite di rilevamento del kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti CHO (3G) era 0,05 fg/μL.
Figura 4. Risultato del test qPCR del DNA CHO (3G)
3.7 Robustezza
Questo kit è stato testato ed è adatto, ma non limitato a, i seguenti strumenti:
| Venditore | Modelli di strumenti | Efficienza di amplificazione | R2 | Limite di quantificazione | Curriculum Vitae | Limite di rilevamento | Tasso di rilevamento |
| Termo | ABI 7500 | 99,69% | 1 | 0,3 fg/μL | 12,40% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
| Termo | ABI QuantStudio5 | 99,26% | 1 | 0,3 fg/μL | 15,30% | 0,05 fg/μL | 100,00% |
| Roche | Ciclo di luce480 | 2,05% | 0,978 | 0,3 fg/μL | / | 0,05 fg/μL | / |
| Shanghai Hong-Shi | SLAN | 101,14% | 0,999 | 0,3 fg/μL | 14,41% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
Tabella 5 Risultati dei test di idoneità dello strumento
3.8 Stabilità
3.8.1 Stabilità al gelo e allo scongelamento
Il kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti CHO (3G) è stato testato mediante ripetuti congelamenti e scongelamenti per 10 volte e le prestazioni del kit non sono state compromesse.
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Indicatori di prova Tempi di congelamento e scongelamento | Parametro | Tempo T0 | Congelare e scongelare 10 volte |
| Parametro della curva standard | Efficienza di amplificazione | 95,70% | 98,62% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Limite di quantificazione (0,3 fg/μL) | Curriculum Vitae | 15,31% | 17,16% |
| Limite di rilevamento (0,05 fg/μL) | Tasso di rilevamento | 95,65% | 100% |
Tabella 6 Analisi dei risultati della stabilità al congelamento-scongelamento
3.7.2 Stabilità accelerata
Il kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti CHO (3G) è stato conservato a 2~8°C per 30 giorni e a 37°C per 14 giorni, rispettivamente. Nessuna delle prestazioni del kit è stata influenzata.
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Indicatori di prova Temperatura e tempo di accelerazione | Parametro | Esperimento 1 | Esperimento 2 | ||
| Tempo T0 | 2~8℃ 30 Giorni | Tempo T0 | 37℃ 14 giorni | ||
| Parametro della curva standard | Efficienza di amplificazione | 100,53% | 102,61% | 101,76% | 101,84% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Limite di quantificazione (0,3 fg/μL) | Curriculum Vitae | 17,16% | 12,63% | 16,27% | 12.49 |
| Limite di rilevamento (0,05 fg/μL) | Tasso di rilevamento | 95,65% | 100% | 95,57% | 100% |
Tabella 7 Analisi accelerata dei risultati di stabilità
3.9 Limite di vuoto
3.9.1 Nessun controllo del modello (NTC)
Il controllo senza modello (NTC) è stata la diluizione del DNA con 96 ripetizioni per eseguire il test quantitativo qPCR; tutti i valori CT superiori ai 96 pozzetti replicati testati erano >40.
Figura 5 Risultati dell'esperimento NTC
3.9.2 Campione di controllo di estrazione negativo (NCS)
Il campione di controllo di estrazione negativo (NCS) era la diluizione del DNA ed è stato prima estratto mediante pretrattamento del campione, quindi è stata eseguita la PCR quantitativa; tutti i valori CT superiori ai 48 pozzetti replicati testati erano >40.
Figura 6 NCS risultati dell'esperimento
- 4.Riferimento
4.1 Commissione per la farmacopea cinese (ChPC). Farmacopea della Repubblica Popolare Cinese (Vol Ⅲ) [S]. Pechino: China Medical Science and Technology Press, p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Principi generali per la revisione tecnica della convalida del metodo analitico per il controllo di qualità dei prodotti biologici.
4.3 ICH(2022)《Validazione del metodo analitico Q2》, versione bozza.
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