La tecnologia di amplificazione isotermica può raggiungere lo scopo di amplificare sequenze specifiche di acidi nucleici in condizioni di temperatura costante. Grazie alle caratteristiche di nessuna attrezzatura speciale, breve tempo di amplificazione ed elevata sensibilità, ha mostrato buone prospettive di applicazione nella rilevazione in loco e nella diagnosi point-of-care ed è molto adatta per lo sviluppo di strumenti diagnostici molecolari.

Nel contesto della pandemia del nuovo coronavirus con l'aumento dei ceppi e dell'infettività, la tecnologia di amplificazione isotermica può rilevare il nuovo coronavirus rapidamente con strumenti semplici, contribuendo a risolvere il problema per cui alcuni pazienti affetti da COVID-19 non possono essere diagnosticati rapidamente a causa dei lunghi tempi di rilevamento e degli elevati requisiti per le apparecchiature di rilevamento e i reagenti delle tecniche PCR tradizionali. Quindi qual è il principio di RT-LAMP, una delle tecniche di amplificazione isotermica? Quali sono le materie prime di alta qualità che Yeasen può fornire?

1. Qual è il principio di RT-LAMP?
2. Progettazione del primer per RT-LAMP
3. Quali materie prime può fornire Yeasen?
4. Guida alla selezione del prodotto

1. Qual è il principio di RT-LAMP?

Nel 2000, gli studiosi giapponesi Notomi e altri hanno creato una nuova tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici chiamata amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). LAMP utilizza 4 primer specifici progettati per 6 regioni del gene bersaglio e utilizza la DNA polimerasi a spostamento di filamento per amplificare 109 copie della sequenza bersaglio in decine di minuti in condizioni isotermiche (60～65 ℃). I risultati sono stati valutati tramite elettroforesi su gel di agarosio e i risultati positivi hanno mostrato bande a forma di scala. LAMP ha le caratteristiche di forte specificità, elevata sensibilità, funzionamento rapido e semplice e basso costo. Con il continuo miglioramento e perfezionamento di questa tecnologia, è attualmente utilizzata nel rilevamento di vari microrganismi patogeni.

RT-LAMP è un metodo in cui la trascrittasi inversa viene aggiunta al sistema di amplificazione LAMP, che può realizzare il rilevamento diretto dell'RNA virale. L'efficienza di amplificazione di LAMP è estremamente elevata, quindi una grande quantità di acido nucleico può essere amplificata con solo una piccola quantità di cDNA. Il tempo di trascrizione inversa nel processo di amplificazione dell'acido nucleico viene risparmiato e la velocità di rilevamento dell'RNA viene accelerata.

Il DNA è in uno stato di equilibrio dinamico a circa 65℃. Sotto l'azione della DNA polimerasi a spostamento di filamento, a partire dall'estremità 3' del segmento F2 del primer FIP, si accoppia con la sequenza complementare del DNA stampo per avviare la sintesi del DNA a spostamento di filamento. Il primer F3 è complementare a F3c all'estremità anteriore di F2c e prende l'estremità 3' come punto di partenza per sintetizzare il suo DNA, sostituendo il filamento di DNA sintetizzato dal primer FIP principale mediante l'azione di una DNA polimerasi a spostamento di filamento. Estendi in avanti. Il filamento di DNA sintetizzato dal primer F3 finale forma un doppio filamento con un filamento di DNA stampo. Il filamento di DNA sintetizzato dal primer FIP viene sostituito dal filamento del primer F3 per generare un singolo filamento. Questo singolo filamento ha segmenti complementari F1c e F1 all'estremità 5', quindi viene eseguito l'appaiamento di basi autonome per formare una struttura circolare. Il primer BIP viene ibridato e combinato con il singolo filamento, e l'estremità 3' del primer BIP viene utilizzata come punto di partenza per sintetizzare un filamento complementare, e la struttura viene aperta nel processo.Quindi, vengono inseriti primer simili a F3 e B3 dal primer BIP, viene eseguito l'appaiamento complementare delle basi e viene sintetizzato un nuovo filamento complementare dall'estremità 3' come punto di partenza. Ci sono sequenze complementari a entrambe le estremità del DNA a singolo filamento sostituito e l'appaiamento delle basi autonome avviene per formare una struttura circolare, quindi l'intera catena presenta una struttura simile a un manubrio. Questa struttura è la struttura di partenza del ciclo di amplificazione del metodo RT-LAMP.

Nella struttura a forma di manubrio, l'estensione del DNA viene eseguita utilizzando il segmento F1 all'estremità 3' come punto di partenza e utilizzando se stesso come modello. E il primer FIP F2 si ibrida con il singolo filamento F2c sul loop per avviare un nuovo ciclo di reazione di spostamento del filamento. L'acido nucleico a doppio filamento sintetizzato dal segmento F1 viene dissociato e, similmente, si forma una struttura circolare sull'acido nucleico. C'è una forma a singolo filamento di B2c sulla struttura circolare e B2 sul primer BIP si ibrida con esso per avviare un nuovo ciclo di amplificazione e una struttura circolare si forma attraverso lo stesso processo. Secondo questo processo, sequenze complementari sullo stesso filamento ciclano attraverso l'appaiamento, l'estensione del filamento e infine formano strutture di diverse dimensioni.

2. Progettazione del primer per RT-LAMP

Il design del primer è la chiave per l'amplificazione e il rilevamento di successo di RT-LAMP. I primer RT-LAMP includono due primer esterni (F3 e B3) e due primer interni (FIP e BIP). Primer F3: il primer esterno a monte, costituito dalla regione F3, è complementare alla regione F3c del gene bersaglio. Primer FIP: primer interno a monte, costituito dalla regione F2, la regione F2c all'estremità 3' del gene bersaglio nella regione F2 è complementare alla regione F1c all'estremità 5' del gene bersaglio. Primer BIP: primer interno a valle, composto dalla regione B2, la regione B2 è complementare alla regione B2c all'estremità 3' del gene bersaglio e ha la stessa sequenza della regione B1c all'estremità 5' del gene bersaglio.

Similmente alla PCR, i principi di progettazione dei primer dovrebbero prestare attenzione a fattori quali composizione della base, contenuto di GC e sottostruttura. Inoltre, si dovrebbero notare i seguenti punti. Le porzioni terminali 5' dei primer interni FIP e BIP, ovvero F1c e B1c, sono generalmente lunghe 8-50 bp. La lunghezza è preferibilmente compresa tra 15 e 25 bp e il valore Tm è maggiore dei valori Tm di F2 e B2 nella porzione terminale 3'. Le porzioni terminali 3' dei primer interni FIP e BIP, ovvero F2 e B2, sono generalmente lunghe 8-50 bp. La lunghezza è preferibilmente compresa tra 15 e 25 bp e il valore Tm è coerente con la temperatura ottimale della DNA polimerasi Bst selezionata nell'esperimento. Le lunghezze dei primer esterni F3 e B3 sono generalmente comprese tra 8 e 50 bp. La lunghezza è preferibilmente 15-25 bp e il suo valore Tm è inferiore a quello di F2 e B2. Quando si progettano i primer, si dovrebbero considerare la struttura del loop e la dimensione della sequenza target. Quando il numero di basi nel loop è maggiore di 40 bp e la dimensione della sequenza target è 130-200 bp, l'efficienza di amplificazione è la più alta.

3. Quali materie prime può fornire Yeasen?

3.1 [Nuovo aggiornamento] Yeasen Bst Più DNA Polimerasi

Il nuovo aggiornamento Hieff™ Bst Plus DNA polimerasi (Cat#14402ES, 14403ES) si ottiene esprimendo e purificando il gene della DNA polimerasi del Bacillus stearothermophilus lo sp privo del dominio esonucleasico 5′→3′ in E. coli.La capacità di spostamento del filamento enzimatico è elevata e presenta i vantaggi di elevata sensibilità, elevata efficienza di amplificazione e elevata tolleranza dUTP, e può essere ampiamente utilizzata nel rilevamento in tempo reale di agenti patogeni basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica.

3.1.1 Veloce e ad alta sensibilità

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase ha un'elevata sensibilità e può rilevare il gene target fino a 5 copie. La quantità di stampo è al livello del femtogramma (fg) e la velocità di amplificazione è più rapida rispetto ai prodotti concorrenti.

Figura 1. La reazione RT-LAMP è stata effettuata con Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (arancione) ed enzimi Bst del concorrente N (grigio) e del concorrente T (blu) per amplificare SARS-CoV-2. I risultati mostrano che Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase può sempre raggiungere la soglia più velocemente dei prodotti concorrenti e la velocità di amplificazione è più rapida.

4. Guida alla selezione del prodotto

I prodotti forniti da Yeasen sono i seguenti:

Tabella 1.Informazioni sul prodotto