L'anticorpo DNA DNA polimerasi anti-TAQ in doppio blocco per aiutare a ridurre l'amplificazione non specifica

La diagnosi molecolare è il sottocampo in più rapido sviluppo nel campo dell'IVD. Presenta i vantaggi di un breve tempo di rilevamento, elevata sensibilità e forte specificità. È ampiamente utilizzata nella diagnosi concomitante dei tumori e nello screening di malattie infettive e genetiche. Nel campo della diagnosi molecolare, la PCR non è solo la piattaforma tecnologica più matura con la più grande quota di mercato, ma anche la tecnologia "gold standard" della diagnosi clinica. Nella tradizionale reazione PCR, si verifica spesso il problema dell'amplificazione non specifica. L'amplificazione non specifica influisce direttamente sull'interpretazione dei risultati di rilevamento e porterà al declino della sensibilità di amplificazione e persino alla resa di frammenti target. Come si verifica l'amplificazione non specifica e come può essere efficacemente evitata?

1. La DNA polimerasi convenzionale può portare ad amplificazione non specifica

2. La polimerasi a caldo può migliorare la specificità dell'amplificazione

3. L'anticorpo Taq a doppio blocco può migliorare ulteriormente la specificità e la stabilità dell'amplificazione

4. Visualizzazione delle prestazioni del Taq a doppio blocco di Yeasen anticorpo

5. Informazioni sul prodotto

1. La DNA polimerasi convenzionale può portare ad amplificazione non specifica

La scarsa specificità di sequenza dei primer è la causa diretta dell'amplificazione non specifica. Come promotore della DNA polimerasi convenzionale, la sua attività esonucleasica può troncare la sequenza del primer del DNA durante la preparazione del sistema PCR, per ridurre la specificità dei primer.

Inoltre, la DNA polimerasi convenzionale non solo ha attività esonucleasica, ma ha anche attività polimerasica. Sebbene la temperatura di estensione ottimale della DNA polimerasi sia 72℃, la polimerasi è ancora attiva a temperatura ambiente. Pertanto, durante la preparazione della reazione PCR e il processo di riscaldamento iniziale, i primer possono formare legami non specifici con alcuni stampi a singolo filamento ed estendersi sotto l'azione della Taq DNA polimerasi, con conseguente amplificazione di sequenze non target e influenzando la specificità della reazione.

Pertanto, i sistemi PCR sono spesso configurati su ghiaccio per inibire l'attività della DNA polimerasi. Sebbene questo metodo sia semplice ed economico, non può inibire completamente l'attività enzimatica, quindi non può eliminare l'amplificazione di prodotti non specifici.

2. La polimerasi a caldo può migliorare la specificità dell'amplificazione

La polimerasi hot start è il componente principale della PCR hot start. A temperatura ambiente, il sito attivo della DNA polimerasi è bloccato da un modificatore enzimatico. Solo dopo la denaturazione della PCR a 95℃, il modificatore enzimatico si dissolve e l'attività enzimatica inizia, evitando l'amplificazione non specifica causata dall'enzima.

Attualmente, i metodi di modifica hot start della DNA polimerasi comunemente usati sul mercato includono principalmente un metodo chimico, un metodo del ligando e un metodo anticorpale. Tra questi, l'effetto bloccante della polimerasi hot start modificata dall'anticorpo è il migliore e la velocità di rilascio dell'attività enzimatica è rapida, il che può ridurre notevolmente il tempo di reazione della PCR. È un metodo di modifica enzimatica hot start ampiamente usato nel mercato IVD.

Tuttavia, occorre notare che il tradizionale metodo di avvio a caldo dell'anticorpo blocca solo l'attività della polimerasi 5'→3' della Taq DNA polimerasi, che può solo prevenire l'amplificazione non specifica causata da discordanze o dimeri di primer a basse temperature.Tuttavia, come accennato in precedenza, la Taq DNA polimerasi non solo ha attività polimerasica 5'→3' ma ha anche attività esonucleasica 5'→3'. Questa attività esonucleasica può portare alla degradazione di sonde non corrispondenti o di altri materiali a basse temperature, con conseguenti segnali non specifici.

3. L'anticorpo Taq a doppio blocco può migliorare ulteriormente la specificità e la stabilità dell'amplificazione

In qualità di leader innovativo nel settore nazionale degli enzimi molecolari, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (di seguito denominata Yeasen) si concentra sulla R&S e sulla produzione di materie prime per enzimi molecolari e osa innovare. Basandosi sulla propria piattaforma di screening di anticorpi maturi, esegue lo screening dell'anticorpo bloccante con la Taq DNA polimerasi come molecola bersaglio. Dopo anni di scrupolosa ricerca e ottimizzazione del sistema, ha sviluppato l'anticorpo anti-Taq DNA polimerasi a doppio blocco, Non solo può bloccare l'attività della polimerasi della Taq DNA polimerasi, ma anche bloccare l'attività dell'esonucleasi della Taq DNA polimerasi. In un approccio a due punte, non solo può prevenire efficacemente l'amplificazione non specifica causata da mismatch o dimero di primer, ma anche impedire che la degradazione del materiale generi segnali non specifici e migliorare doppiamente la stabilità del reagente.

4. Visualizzazione delle prestazioni del Taq a doppio blocco di Yeasen anticorpo

4.1 L'uso dell'anticorpo Taq a doppio blocco è accurato e più sensibile

Dopo aver bloccato la Taq polimerasi con l'anticorpo a doppio blocco di Yeasen e l'anticorpo della società T, i campioni positivi sono stati rilevati tramite ARMS-PCR.

Figura 1. Curva di amplificazione ARMS-PCR; Blu: anticorpo bloccante dell'azienda T; Rosso: anticorpo a doppio blocco di Yeasen

Dalla Figura 1 si può osservare che la Taq polimerasi bloccata dall'anticorpo a doppio blocco di Yeasen presenta una tipizzazione accurata e una maggiore sensibilità nell'amplificazione ARMS-PCR.

4.2 L'anticorpo Taq a doppio blocco è efficace Ha bloccato l'attività esonucleasica della Taq DNA polimerasi

Le sonde primer sintetizzate sono state abbinate alla soluzione di reazione della Taq DNA polimerasi bloccata rispettivamente da anticorpi non chiusi e doppi bloccati e sono state fatte reagire a 40℃ per rilevarne i segnali di fluorescenza.

Figura 2. Rilevamento dell'efficienza di blocco dell'anticorpo a doppio blocco per l'attività esonucleasica; Giallo: gruppo Taq DNA polimerasi non chiuso; Viola: gruppo Taq DNA polimerasi bloccato dall'anticorpo a doppio blocco

Come si può vedere dalla Figura 2 che l'anticorpo a doppio blocco può bloccare efficacemente l'attività esonucleasica della Taq DNA polimerasi.

4.3 L'anticorpo Taq a doppio blocco può migliorare efficacemente la stabilità del reagente di rilevamento

La Taq DNA polimerasi è stata bloccata rispettivamente con un anticorpo bloccante tradizionale e un anticorpo a doppio blocco e configurata in una premiscela completa contenente una sonda primer. 10000 copie del plasmide ASF sono state amplificate a 4℃ per 10 giorni o a 37℃ per 1, 3 e 5 giorni. Sono state osservate le variazioni della curva di amplificazione e del valore Ct e sono stati confrontati gli effetti dell'anticorpo bloccante tradizionale e dell'anticorpo a doppio blocco sulla stabilità della soluzione di reazione della premiscela completa.

Figura 3.Curva di amplificazione di 10000 copie del plasmide ASF amplificato mediante la soluzione di reazione di blocco dell'anticorpo di blocco tradizionale (a) e dell'anticorpo a doppio blocco (b); Blu: conservare a 4℃ per 10 giorni; Rosso: posto a 4℃ per 0 giorni (controllo)

Dalla Figura 3 si può vedere che l'anticorpo a doppio blocco può mantenere la stabilità della soluzione di reazione e migliorare efficacemente la stabilità del reagente di rilevamento rispetto all'anticorpo di blocco tradizionale. La curva di amplificazione e il valore Ct non sono cambiati in modo significativo dopo che l'intera premiscela contenente la sonda primer è stata bloccata da un anticorpo a doppio blocco e posta a 4℃ per 10 giorni.

Figura 4. Curva di amplificazione di 10000 copie del plasmide ASF amplificato mediante la soluzione di reazione di blocco dell'anticorpo di blocco tradizionale (a) e dell'anticorpo a doppio blocco (b); Blu: conservare a 37℃ per 5 giorni; Verde: 37℃ per 3 giorni; Giallo: 37℃ per 1 giorno; Rosso: posto a 37℃ per 0 giorni (controllo)

Dalla Figura 4 si può vedere che l'anticorpo a doppio blocco può mantenere la stabilità della soluzione di reazione e migliorare efficacemente la stabilità del reagente di rilevamento rispetto all'anticorpo di blocco tradizionale. L'anticorpo a doppio blocco blocca l'intero premiscelato contenente il primer-sonda e la differenza del valore Ct è inferiore a 0,2 dopo essere stato posizionato a 37℃ per 1, 3 e 5 giorni.

4.4 L'anticorpo Taq a doppio blocco aiuta a risolvere il problema della deriva della linea di base

Quando alcuni primer cooperano con un buffer e strumenti specifici, si verificherà una deriva della linea di base. Yeasen ha provato molti metodi per migliorare il problema della linea di base e ha scoperto che l'anticorpo a doppio blocco era più favorevole a una linea di base stabile.

Figura 5. Curva di amplificazione del gene N (a) e del gene ACT (b); Rosso: anticorpo bloccante tradizionale; Verde: anticorpo a doppio blocco

Come si può vedere dalla Figura 5, l'uso di anticorpi a doppio blocco sotto primer e tamponi specifici può aiutare a risolvere il problema della deriva della linea di base.

4.5 Una buona linearità è stata ottenuta utilizzando l'anticorpo Taq a doppio blocco

Sono state amplificate 100000, 10000, 1000 e 100 copie di doppi plasmidi ASF/ACT con la soluzione di reazione bloccata da un anticorpo a doppio blocco ed è stata tracciata la curva standard.

Figura 6. Curve standard del gene ASF (a) e del gene ACT (b) prodotte dalla soluzione di reazione a doppio blocco

Come si può vedere dalla Figura 6, la curva standard R2 del gene ASF è 0,998 e l'efficienza di amplificazione è 98,848%; La curva standard R2 del gene ACT era pari a 0,998 e l'efficienza di amplificazione era del 98,113%.

4.6 Taq a doppio blocco L'anticorpo può rilasciare rapidamente l'attività enzimatica

La Taq polimerasi è stata bloccata con l'anticorpo importato dalla società T e Anticorpo a doppio blocco di Yeasen (cat#31303) rispettivamente, e l'attività enzimatica è stata rilevata dopo shock termico a 95℃ per 20 s. Si può vedere che 31303 può rilasciare più del 95% dell'attività enzimatica dopo shock termico a 95℃ per 20 s, il che è equivalente all'anticorpo della società T.

Tabella 1. Attività enzimatica

4.7 Taq a doppio blocco Anticorpo Può bloccare molti tipi di enzimi Taq

Tre tipi di enzimi Taq (wild type e 2 mutanti) sono stati bloccati dall'anticorpo a doppio blocco di Yeasen (cat#31303) e il rapporto di blocco era di 1 μ g: 5 U, misurando il valore di fluorescenza e l'efficienza di sigillatura. Si può vedere che l'effetto di blocco dell'anticorpo a doppio blocco di Yeasen (cat#31303) è migliore per diversi tipi di enzimi Taq.

Tabella 2. Efficienza di blocco di diversi tipi di enzimi Taq

4.8 Di Yeasen L'anticorpo Taq a doppio blocco non aveva residui genomici nei topi

Prendendo l'acqua come modello per il controllo negativo e il genoma del topo come modello per il controllo positivo, sono stati amplificati 31303 lotti diversi. Si è scoperto che il frammento target non era amplificato nel campione, il che indica che non c'era alcun residuo di genoma del topo nell'anticorpo.

Figura 7. Diagramma di rilevamento dei residui del genoma del topo

Nota: - è il controllo negativo, + è un controllo positivo e 1-5 sono 31303 campioni di lotti diversi

5. Informazioni sul prodotto