dNTP sta per ribonucleotide trifosfato modellato utilizzato nella PCR, in grado di amplificare un filamento di DNA in crescita. In altre parole, i dNTP nella PCR si inseriscono nei filamenti di DNA complementari tramite legami idrogeno e i filamenti di DNA in crescita vengono espansi con l'aiuto della Taq DNA polimerasi. Qual è l'applicazione specifica del dNTP nella PCR? Quali sono le proprietà che i dNTP ad alta purezza devono avere?

1. Cosa sono i dNTP?
2. Qual è la concentrazione di dNTP nella PCR?
3. Quali sono le proprietà richieste per il dNTP ad alta purezza?
4. Prodotti correlati e prestazioni

1. Cosa sono i dNTP?

I deossinucleoside trifosfati (dNTP) sono nucleosidi trifosfati contenenti desossiribosio, una catena di nucleotidi composta da ribosio, una base e un fosfato. I dNTP sono i mattoni essenziali delle molecole di acido nucleico e, in quanto tali, sono componenti necessari delle miscele PCR poiché nessun nuovo DNA amplificato potrebbe essere generato senza di essi. I quattro singoli deossinucleotidi che compongono una sequenza di DNA includono deossiadenosina trifosfato (dATP), deossitimidina trifosfato (dTTP), deossicitidina trifosfato (dCTP) e deossiguanosina trifosfato (dGTP). Inoltre, la qualità dei dNTP è anche critica per il successo di molte procedure come PCR, sintesi di cDNA, qPCR, sequenziamento, clonazione ed etichettatura del DNA.

Esistono quattro tipi di dNTP, o deossinucleotide trifosfato, ognuno dei quali utilizza una base di DNA diversa: adenina (dATP), citosina (dCTP), guanina (dGTP) e timina (dTTP). L'utilizzo di dNTP durante la fase di estensione fornisce basi singole pronte per entrare nel DNA e raddoppiarlo, come mattoni. Poiché lo scopo della tecnica è sintetizzare nuovo DNA, dNTP fornisce nucleotidi al filamento "decompresso" utilizzando il modello di un singolo lato. Ciò trasforma un singolo filamento di DNA in due e può continuare esponenzialmente finché i reagenti rimangono presenti fino alla fase di attesa finale.

2. Qual è la concentrazione di dNTP nella PCR?

La PCR è una tecnica in vitro di sintesi del DNA che viene eseguita per generare copie multiple di un frammento di DNA di interesse in modo che possa essere visualizzato tramite elettroforesi su gel. Lo scopo della PCR è di creare un gran numero di copie di DNA per varie applicazioni downstream nel sequenziamento del DNA o nei microarray di DNA. I suoi componenti includono modelli di DNA, primer, buffer e Taq DNA polimerasi dNTP. Per comprendere il meccanismo della PCR, è necessario comprendere l'importanza e il principio dei componenti utilizzati. dNTP è uno dei componenti chiave della PCR. La funzione dei dNTP nella PCR è di amplificare il filamento di DNA in crescita con l'aiuto della Taq DNA polimerasi e di combinarsi con il filamento di DNA complementare tramite legame idrogeno.

Il processo di PCR è suddiviso in tre fasi dipendenti dalla temperatura: denaturazione, annealing ed estensione. Durante la fase di denaturazione, il DNA a doppio filamento viene denaturato in DNA a singolo filamento. Durante la fase di annealing, i primer si legano nella posizione esatta della loro sequenza complementare e durante la fase di estensione, la Taq DNA polimerasi aggiunge dNTP al filamento di DNA in crescita. Una volta che i filamenti sono aperti e i primer si legano al DNA a singolo filamento, la Taq DNA polimerasi inizia la sua attività catalitica. Nella fase successiva, inizia l'aggiunta di dNTP, che si lega al complesso P-DNA con minore affinità se è presente l'esatto nucleotide complementare. Poco dopo che la Taq DNA polimerasi si è stabilizzata, si verificano interazioni di legame idrogeno tra basi complementari e dNTP. Qui non è l'intero nucleotide all'inizio, ma la base (base azotata) sul dNTP che decide se legarsi o meno.Innanzitutto, se trova una base complementare (A per T, G per C) sullo stampo ssDNA, formerà un legame idrogeno tra di loro. Vengono creati tre legami idrogeno tra C e G e due legami idrogeno tra A e T. Una volta formato il legame idrogeno, la Taq DNA polimerasi si conforma all'incorporazione del dNTP nel filamento di DNA in crescita formando un legame fosfodiesterico. Ora, dopo che il legame fosfodiesterico è stato formato, la Taq DNA polimerasi fa un ulteriore passo avanti nell'aggiungere nuovi dNTP. Si forma un legame fosfodiesterico tra il 3'OH del primer e il 5'P del dNTP. Dopo il legame idrogeno, la Taq DNA polimerasi catalizza la reazione rimuovendo i gamma e i beta-fosfati dai trifosfati dei dNTP. Dopo che la reazione è completa, vengono rilasciati due pirofosfati (PPi). Ma la cinetica esatta dell'interazione tra dNTP e Taq polimerasi nelle reazioni PCR rimane sconosciuta.

Questi quattro nucleotidi vengono in genere aggiunti alla reazione PCR in quantità equimolari per un'incorporazione ottimale della base. Tuttavia, in determinate situazioni come la mutagenesi casuale tramite PCR, vengono intenzionalmente fornite concentrazioni di dNTP non bilanciate per promuovere un grado più elevato di errata incorporazione da parte di una DNA polimerasi non di correzione di bozze. Il fattore che determina la concentrazione minima di dNTP è la lunghezza del DNA e la composizione della sequenza target. Nella reazione PCR, il dNTP è generalmente 50-200 μmol/L. Quando la concentrazione finale di dNTP è maggiore di 50 mmol/L, può inibire l'attività della Taq DNA polimerasi. Le concentrazioni dei quattro dNTP devono essere uguali per ridurre l'incorporazione errata durante l'amplificazione a causa della mancanza di un dNTP.

Nelle comuni applicazioni PCR, la concentrazione finale consigliata di ciascun dNTP è solitamente 0,2 mM. Concentrazioni più elevate possono essere utili in alcuni casi, specialmente in presenza di elevate concentrazioni di Mg²⁺, come Mg²⁺ si lega ai dNTP e riduce il loro tasso di incorporazione, aumentando il tasso non specifico. Il dNTP contiene fosfato, che può combinarsi con Mg²⁺ per ridurre la concentrazione di Mg libero²⁺, quindi il cambiamento nella sua concentrazione influenzerà la concentrazione effettiva di Mg²⁺In condizioni di elevata concentrazione di DNA e dNTP, il Mg²⁺ la concentrazione dovrebbe essere regolata di conseguenza. Inoltre, la scarsità di dNTP porta a prodotti PCR incompleti. Tuttavia, i dNTP che superano le concentrazioni ottimali possono inibire la PCR. Per un'incorporazione efficiente da parte della DNA polimerasi, i dNTP liberi dovrebbero essere presenti nella reazione a una concentrazione non inferiore a 0,01-0,015 mM.

3. Quali sono le proprietà richieste per il dNTP ad alta purezza?

Sin dalla sua scoperta, la reazione a catena della polimerasi è lo strumento ineguagliabile utilizzato nella ricerca genetica molecolare. Il dNTP è impiegato nella PCR per espandere il filamento di DNA in crescita. Anche se la qualità del dNTP nel sistema è scarsa, avrà un impatto negativo sulle proprietà del prodotto finale. Il dNTP ad alta purezza di Yeasen è adatto a tutti i tipi di applicazioni di sintesi del DNA altamente sensibili e riproducibili.

Yeasen offre nucleotidi, set e miscele di grado GMP pronti all'uso, forniti come sali di sodio in acqua purificata a pH 7,0. Il processo di produzione elimina impurità e inibitori specifici della PCR e i dNTP sono realizzati appositamente per applicazioni di biologia molecolare. I dNTP sono purificati con HPLC preparativa e possiedono almeno il 99% di purezza. Possono essere utilizzati nei processi di PCR, RT-qPCR, LAMP, etichettatura del DNA e sequenziamento del DNA.
Rigorosi standard di controllo e tecnologia all'avanguardia garantiscono la migliore qualità del prodotto. Ogni lotto di dNTP viene testato per vari residui (DNA batterico, DNA umano, DNasi, RNasi, endonucleasi).Il prodotto è stabile da lotto a lotto e adatto a tutti i tipi di applicazioni di sintesi del DNA altamente sensibili e riproducibili.

4. Prodotti correlati e prestazioni

4.1 Nessun residuo di DNA batterico

Figura 1. I risultati del rilevamento mostrano che i dNTP non presentano residui del genoma batterico.

4.2 Nessun residuo di DNA umano

Figura 2. I risultati del rilevamento mostrano che i dNTP non hanno residui del genoma umano.

4.3 Nessuna contaminazione da DNasi, RNasi ed endonucleasi

Figura 3. I risultati del rilevamento mostrano che i dNTP non hanno DNasi, RNasi ed endonucleasi.

4.4 Amplificazione PCR (20 kb DNA)

Figura 4. Il risultato dell'amplificazione PCR è il prodotto previsto da 20 kb.

4.5 Informazioni sui prodotti

I prodotti forniti da Yeasen sono i seguenti.

Tabella 1.Informazioni sui prodotti