Negli ultimi anni, lo sviluppo e l'applicazione della tecnologia mRNA hanno continuato ad attirare l'attenzione. I farmaci mRNA comportano l'inoculazione di mRNA che codifica proteine antigeniche nel corpo umano. Utilizzando il materiale genetico all'interno delle cellule umane, esprimono e sintetizzano proteine antigeniche. Questo processo induce e attiva il sistema immunitario del corpo attraverso proteine antigeniche, mirando a prevenire e curare le malattie. I farmaci mRNA hanno vantaggi come sicurezza, efficienza e un ciclo breve. Possono indurre simultaneamente immunità umorale e cellulare e sono stati applicati in varie indicazioni, tra cui tumori, malattie infettive, malattie rare, malattie cardiovascolari e altro ancora.
L'intero processo di sviluppo del farmaco a mRNA può essere suddiviso grossolanamente in diverse fasi:
Determinazione e progettazione della sequenza: trascrizione in vitro dell'mRNA, preparazione dell'incapsulamento
IL convenzionale le fasi della trascrizione in vitro dell'mRNA (IVT) includono:
Estrazione e linearizzazione del DNA plasmidico—Purificazione del DNA plasmidico—Trascrizione in vitro (co-transcriptional capping)—Purificazione—Soluzione madre di mRNA
IL una pentola Il processo di trascrizione in vitro (IVT) dell'mRNA include:
Estrazione e linearizzazione del DNA plasmidico—Trascrizione in vitro (capping co-trascrizionale)—Purificazione—Soluzione madre di mRNA
Attualmente, la maggior parte dei processi esistenti prevede un singolo passaggio di purificazione per il DNA plasmidico dopo la scissione enzimatica prima del passaggio IVT. Yeasen Biotechlogy, sulla base di un centro di sviluppo di applicazioni mRNA mature, ha sviluppato il processo "Onepot mRNA Transcription". In questo processo, il DNA plasmidico circolare non viene purificato dopo la scissione enzimatica; al contrario, viene utilizzato direttamente per la trascrizione in vitro, con conseguente soluzione madre mRNA di alta qualità. Questo intero processo, pur garantendo la qualità del prodotto e del processo, riduce la durata del processo esistente.
Vantaggi del processo:
- Ottimizzazione dei processi, riduzione dei passaggi IVT per un funzionamento più semplice.
- Costi dei materiali inferiori, eliminando la necessità di purificazione post-scissione e di controllo qualità.
- Mantenimento della qualità e della resa dell'mRNA.
Dati:
1. Rendimenti e Integrità:
Utilizzando il 1μg di plasmidi linearizzati 2K, 4K e 9K, il processo onepot può generare 150-200μg di mRNA.
| Lunghezza | Rendimenti | Integrità |
| 2K | 200 microgrammi | 94,00% |
| 4K | 185 microgrammi | 92,20% |
| 9K | 150 μg | 87,50% |
Il test di integrità è stato eseguito utilizzando l'elettroforesi capillare (CE) per valutare l'integrità dei frammenti con lunghezze di 2K, 4K e 9K. L'integrità dei frammenti 2K e 4K era >92% e l'integrità dei frammenti 9K era >87%.
2. Rilevamento dell'efficienza di capping dell'mRNA
È stata utilizzata la LC-MS per valutare l'efficienza di capping della sequenza 2K, rivelando un'efficienza di capping del 99,5%.
Immagine in alto: cromatogramma UV HPLC
Immagine in basso: Spettro del peso molecolare deconvoluto
3. Rilevamento dell'efficienza della poliadenilazione dell'mRNA
È stata utilizzata la LC-MS per rilevare l'efficienza di poliadenilazione dei campioni, mostrando risultati distribuiti normalmente.
Immagine in alto: cromatografia liquida TIC cromatogramma
Immagine in basso: Spettro del peso molecolare deconvoluto
4.Espressione mRNA Saggio
Trasfezione di cellule 293T con prodotti mRNA sintetizzati utilizzando entrambi i convenzionale processo (A sinistra, plasmidi linearizzati iocon purificazione) e il processo one-pot (a destra, plasmidi linearizzati senza purificazione) non ha mostrato alcuna differenza nell'espressione della proteina fluorescente dopo 24 ore di coltura.
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