Nonostante i buoni risultati ottenuti durante la pandemia e il grande potenziale, la tecnologia mRNA presenta ancora diverse limitazioni, come tempi di espressione brevi e traduzione proteica limitata. Mentre queste caratteristiche possono fornire un certo livello di sicurezza, diventano limitazioni per terapie come la sostituzione proteica. Ciò richiede dosaggi ripetuti per mantenere i livelli di espressione proteica, introducendo nuovi rischi e sfide come l'immunogenicità e gli anticorpi neutralizzanti.
L'RNA auto-amplificante (saRNA) può generare la stessa risposta immunitaria a dosi centinaia o persino migliaia di volte inferiori rispetto all'mRNA tradizionale. Dosi inferiori comportano costi di produzione inferiori e iniezioni meno frequenti possono ridurre i potenziali effetti collaterali tossici dell'mRNA e dei vettori di somministrazione. Attualmente, diversi candidati saRNA sono entrati in sperimentazioni cliniche in tutto il mondo. Grandi aziende come BioNTech stanno attivamente sviluppando pipeline di tecnologia saRNA.
Sebbene il saRNA offra notevoli vantaggi in termini di costi e sicurezza, la sua struttura unica presenta nuove sfide produttive. La molecola del saRNA, che combina la sequenza che codifica per l'RNA polimerasi con la sequenza proteica target, è molto più grande (~10 kb) e più complessa (contiene più strutture secondarie) rispetto al tradizionale mRNA. Ciò aumenta significativamente la difficoltà delle reazioni di trascrizione in vitro, riducendo la resa e la purezza della produzione del saRNA. Pertanto, la produzione del saRNA richiede standard più elevati nei processi di sintesi, separazione e purificazione.
La cromatografia di affinità, un metodo utilizzato per la separazione e la purificazione, presenta problemi quali bassa resa del prodotto target e integrità. La combinazione di più metodi di purificazione cromatografica (ad esempio, aggiunta di cromatografia su cellulosa, cromatografia in fase inversa idrofobica) è macchinosa, introduce nuove impurità, ha bassi tassi di recupero ed è costosa. Inoltre, il sistema di reazione IVT utilizzato per la produzione su larga scala è ottimizzato da sistemi adatti per la sintesi di sequenze di acidi nucleici da 100 nt, rendendolo inadatto per saRNA, che supera i 10 kb di dimensione. Ciò richiede l'ottimizzazione dei sistemi di reazione IVT esistenti. Attualmente, i metodi di purificazione dell'mRNA convenzionali non possono soddisfare i requisiti di qualità del liquido grezzo industriale. Pertanto, vi è un'urgente necessità di sviluppare e ottimizzare un processo di separazione e purificazione di livello industriale completo ed efficiente per l'RNA autoamplificante.
Ottimizzazione dei metodi di produzione e purificazione industriale
Per sviluppare un sistema di produzione industriale per l'mRNA auto-amplificante (saRNA), è essenziale ottimizzare innanzitutto i tipi di ioni tampone e i componenti nel sistema di cotrascrizione IVT su piccola scala. Ciò comporta anche la raffinazione del tampone cromatografico e dei rapporti di lavaggio del campione per i processi di purificazione a valle. Queste condizioni ottimizzate possono quindi essere estese alla produzione su larga scala per verificare se il sistema può effettivamente aumentare la capacità produttiva e migliorare la qualità del prodotto grezzo.
Sistema di reazione di aggiunta di cappucci di cotrascrizione
Nel sistema di reazione di aggiunta del cappuccio di cotrascrizione, i componenti del tampone T7 includono 400 mM di HEPES, 20 mM di spermidina, 100 mM di DTT e sali di Mg2+.
T7 Buffer - Tipo di sale di ioni di magnesio
Il tipo di sale di ioni di magnesio utilizzato influisce sulla resa e sull'integrità del prodotto saRNA target.
- Per la sintesi di co-trascrizione su piccola scala di 1 mg di mRNA, l'utilizzo di Mg(OAc)2 come sale di Mg2+ determina la migliore resa e integrità, con valori rispettivamente di 100,5 µg e 62,9%.
- Al contrario, l'uso di altri sali di ioni magnesio come MgCl2 e MgSO4 riduce la resa di circa il 25-50% e l'integrità di circa il 10%, abbassando significativamente sia la resa che l'integrità.
Tampone T7 - Concentrazione di ioni di magnesio
Una concentrazione ottimale di ioni acetato di magnesio (30-50 mM) aumenta la resa e l'integrità del saRNA target, con risultati ottimali a 35 mM.
- Con una concentrazione di ioni acetato di magnesio pari a 30-50 mM, la resa di saRNA raggiunge 88,5-100,5 µg e l'integrità è del 58,6-62,9%, mostrando buoni risultati.
- A una concentrazione di 35 mM, la resa e l'integrità sono massime, raggiungendo rispettivamente 100,5 µg e 62,9%.
Tampone T7 - Sale di ioni di magnesio combinato con altri sali
L'aggiunta di altri sali al tampone T7 può migliorare significativamente la resa e l'integrità del prodotto target.
- Il tampone base T7 comprende 400 mM di HEPES, 20 mM di spermidina, 100 mM di DTT e sali di Mg2+, con una resa e un'integrità rispettivamente di 100,5 µg e 62,9%.
- L'aggiunta di un secondo sale, NaOAc, migliora ulteriormente la resa e l'integrità: la resa aumenta di 20-110 µg e l'integrità migliora di circa il 2-8%.
Tampone T7 - Concentrazione dei sali combinati
Quando il secondo componente salino NaOAc (Na+) raggiunge una concentrazione di 5-30 mM, la resa e l'integrità del saRNA target migliorano significativamente, con la concentrazione migliore a 15 mM.
- A concentrazioni di Na+ di 3-30 mM, la resa di saRNA raggiunge 120-210 µg e l'integrità è del 64,4-70,2%, mostrando buoni risultati.
- A una concentrazione di Na+ di 15 mM, la resa e l'integrità sono massime, raggiungendo rispettivamente 210 µg e 70,2%.
Metodi di purificazione singoli
Durante la produzione e la purificazione di saRNA su piccola scala (<50 mg), l'utilizzo di diversi metodi di purificazione può ridurre significativamente il contenuto di dsRNA e i residui proteici, garantendo un'elevata resa, efficienza di capping e integrità del prodotto. L'efficacia dei metodi di purificazione dal migliore al peggiore è: cromatografia di affinità > precipitazione del cloruro di litio > ultrafiltrazione, cromatografia di cellulosa.
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Cromatografia di affinità
Per la produzione di mRNA su larga scala, è preferibile la cromatografia. Le opzioni includono la cromatografia in fase inversa, a scambio ionico, idrofobica e di affinità, ciascuna con i suoi pro e contro. La cromatografia di affinità, spesso utilizzata per catturare mRNA di poli(A), offre soluzioni di scalabilità e piattaforma con tassi di recupero >90%.
Le caratteristiche strutturali chiave dell'mRNA, il cappuccio 5' e la coda di poli(A) 3', facilitano la purificazione. La cromatografia di affinità, simile alla purificazione con perle magnetiche, utilizza perle legate a dT per catturare l'mRNA della coda di poli(A). Le condizioni di elevata salinità schermano le cariche negative, consentendo il legame tramite legami idrogeno AT, e l'mRNA viene eluito a pH neutro moderato e bassa conduttività.
La cromatografia di affinità per l'RNA comporta "elevato legame salino, bassa eluizione salina". La composizione del tampone, le dimensioni molecolari, la temperatura e la concentrazione del campione hanno un impatto significativo sul processo. La selezione del tipo di sale e della concentrazione ottimali tramite sperimentazione è essenziale per una purificazione efficiente.
Purificazione: questo metodo produce la massima integrità del prodotto (80,3%), il più basso contenuto di dsRNA (0,01 µg/mg), la più alta efficienza di capping (96,4%) e il minor numero di residui proteici (1,20 µg/mg), con una resa di 136 µg e un tasso di recupero del 65%, il che lo rende il migliore in termini di purezza e qualità del prodotto.
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Altri metodi di purificazione:
Precipitazione del cloruro di litio
Il principio della purificazione dell'mRNA mediante LiCl è che il litio può ridurre la repulsione elettrostatica tra le molecole a un certo pH, consentendo un'efficiente precipitazione dell'RNA.Il precipitato viene quindi separato per centrifugazione, disciolto per ottenere un campione di RNA puro. La precipitazione con LiCl è semplice, veloce, efficace per mRNA di varie dimensioni e produce prodotti ad alta purezza. Tuttavia, gli ioni di litio residui possono inibire l'mRNA. Si consiglia di utilizzare la precipitazione con LiCl per soluzioni contenenti almeno 400 µg/ml di RNA per garantire l'efficienza di purificazione. Questo metodo produce un'elevata resa (210µg), ma l'integrità del prodotto è solo del 70,2%, riducendo significativamente la qualità del prodotto. Non è adatto per la produzione su larga scala.
Metodo delle perle magnetiche:
Le perle magnetiche sono piccole particelle che si muovono direzionalmente sotto un campo magnetico, tipicamente composte da un nucleo di ossido di ferro e un rivestimento esterno. La purificazione delle perle magnetiche è una comune tecnica di biologia molecolare per arricchire rapidamente ed efficientemente le molecole di mRNA da miscele. Le diverse perle magnetiche funzionali hanno diversi gruppi funzionali di superficie (ad esempio, idrossile, carbossile, Oligo(dT), streptavidina) per purificare varie biomolecole.
Le perle magnetiche carbossilate possono purificare in modo efficiente gli acidi nucleici, con le molecole di mRNA che si legano tramite interazioni elettrostatiche in condizioni acide. La regolazione delle condizioni consente il legame selettivo e il rilascio di mRNA. Gli mRNA più lunghi con più gruppi fosfato caricati negativamente esposti si legano più facilmente alle perle. Per mRNA più corti, potrebbero essere necessari volumi di perle maggiori. Le perle magnetiche accoppiate a oligo(dT), simili alla cromatografia di affinità, utilizzano un legame specifico tra la coda di poli(A) dell'mRNA e l'Oligo(dT) delle perle.
Ultrafiltrazione
Questo metodo determina la più bassa integrità del saRNA, circa l'8% in meno rispetto alla cromatografia di affinità, con il più alto residuo proteico (4,58 µg/mg).
Cromatografia di cellulosa
Questo metodo raggiunge un basso contenuto di dsRNA (0,009 µg/mg) e un alto tasso di capping (96,4%). Tuttavia, i residui proteici sono leggermente più alti (5,30 µg/mg), con un tasso di recupero di solo il 57% e una resa di 120 µg, entrambi significativamente inferiori a quelli ottenuti con la cromatografia di affinità (rispettivamente di circa il 10% e 16 µg).
Processo di purificazione
Componenti del tampone cromatografico - Aggiunta di agenti riducenti
L'aggiunta di agenti riducenti al tampone cromatografico durante la purificazione può migliorare significativamente l'integrità del prodotto, il tasso di recupero e l'efficienza di capping, riducendo al contempo i livelli di dsRNA e residui proteici come sottoprodotto rispetto alla mancata aggiunta di agenti riducenti.
- Senza agenti riducenti:
- Resa: 136µg
- Tasso di recupero: 65%
- Integrità: 80,3%
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: 1,20 µg/mg
- La purezza e la qualità del prodotto sono buone.
- Con agenti riducenti (TCPE, DTT, β-mercaptoetanolo):
- La resa aumenta di 10-40 µg
- Il tasso di recupero aumenta del 5-18%
- L'integrità migliora di circa l'1-5%
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- dsRNA: fino a 0,005 µg/mg
- Residuo proteico: fino a 0,20 µg/mg
- Miglioramento significativo della purezza e della qualità del prodotto.
Componenti del tampone cromatografico - Tipi di agenti riducenti
Diversi tipi di agenti riducenti aggiunti al tampone cromatografico possono migliorare ulteriormente l'integrità del prodotto, il tasso di recupero e l'efficienza di capping, riducendo al contempo i residui di dsRNA e proteine. Il TCPE è risultato essere l'agente riducente più efficace.
- Con TCPE:
- Resa: 175µg
- Tasso di recupero: 83%
- Integrità: 85,2%
- dsRNA: 0,005µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: 0,20 µg/mg
- Eccellente purezza e qualità del prodotto.
Componenti del tampone cromatografico - Concentrazione degli agenti riducenti
L'aggiunta di agenti riducenti a una concentrazione di 5-15 mM nel tampone cromatografico può migliorare significativamente l'integrità del prodotto, il tasso di recupero e l'efficienza di capping, riducendo al contempo i residui di dsRNA e proteine. La concentrazione ottimale è 10 mM.
- Aggiunta di 5-15 mM di TCPE:
- Resa: 160-178µg
- Tasso di recupero: 76-85%
- Integrità: circa 85%
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: 0,20-0,52 µg/mg
- Buona purezza e qualità del prodotto.
- Con 10 mM TCPE:
- Resa: 178µg
- Tasso di recupero: 85%
- Integrità: 85,4%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: 0,20 µg/mg
- Purezza e qualità ottimali del prodotto.
Rapporto di lavaggio
Il controllo del rapporto tra tampone cromatografico e acqua di iniezione nel processo di lavaggio (10-25):(75-90) può migliorare significativamente l'integrità del prodotto, il tasso di recupero e l'efficienza di capping, riducendo al contempo i residui di dsRNA e proteine. Il rapporto ottimale è 15:85.
- Rapporto (10-25):(75-90):
- Resa: 150-179µg
- Tasso di recupero: 71-85%
- Integrità: 84-90%
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: circa 0,20 µg/mg
- Buona purezza e qualità del prodotto.
- Con rapporto 15:85:
- Resa: 179µg
- Tasso di recupero: 85%
- Integrità: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: 0,20 µg/mg
- Purezza e qualità ottimali del prodotto.
Metodi di purificazione combinati
L'uso di una combinazione di diversi metodi di purificazione può ridurre ulteriormente i livelli di dsRNA e residui proteici nel prodotto, migliorando la qualità complessiva. L'ordine preferito dei metodi di purificazione è: cromatografia di affinità > ultrafiltrazione + cromatografia di affinità > cromatografia di affinità + cromatografia di cellulosa > cromatografia di cellulosa + ultrafiltrazione. La cromatografia di affinità da sola fornisce i risultati migliori.
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Solo cromatografia di affinità:
- Resa: 179µg
- Tasso di recupero: 85%
- Integrità: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Efficienza di tappatura: 96,4%
- Residuo proteico: 0,20 µg/mg
- Massima purezza e qualità del prodotto.
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Ultrafiltrazione + cromatografia di affinità:
- Resa: 170µg (9µg in meno rispetto alla sola cromatografia di affinità)
- Tasso di recupero: 81% (4% in meno rispetto alla sola cromatografia di affinità)
- Integrità: 88,5%
- dsRNA: 0,0015µg/mg
- Residuo proteico: 0,18 µg/mg
- Leggera riduzione di dsRNA e residui proteici rispetto alla sola cromatografia di affinità, ma significativa riduzione di resa e tasso di recupero. Questo metodo è più complesso, raddoppia il tempo di purificazione e aumenta i costi.
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Cromatografia di affinità + cromatografia di cellulosa / cromatografia di cellulosa + ultrafiltrazione:
- dsRNA: 0,005µg/mg inferiore rispetto ai metodi singoli
- Resa: 60-100µg in meno
- Tasso di recupero: 30-40% inferiore
- L'aumento dei passaggi comporta maggiori costi di manodopera e materiali.
Produzione su larga scala
Nella produzione su larga scala, utilizzando la cromatografia di affinità, la cromatografia di affinità combinata con la cromatografia di cellulosa o l'ultrafiltrazione combinata con la cromatografia di affinità, la resa di mRNA auto-amplificante aumenta significativamente a 140-185 µg, con un tasso di recupero del 67-88%. L'integrità del prodotto è del 93-94%, il contenuto di dsRNA è controllato entro 0,0018-0,0020 µg/mg, l'efficienza di capping raggiunge il 96,1-96,4% e i residui proteici sono mantenuti entro 0,04-0,05 µg/mg. Ciò dimostra una buona scalabilità ed efficienza per la produzione su larga scala.
Riferimento:
[8] Metodi di produzione industriale e di purificazione della separazione del liquido grezzo di mRNA autoamplificante e sue applicazioni [P]. Brevetto: CN118048418A. 17/05/2024.
Informazioni per l'ordinazione
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