La struttura Cap è una componente essenziale nello sviluppo di vaccini e terapie mRNA. La tecnologia mRNA sintetica si basa su Cap1 per migliorare la stabilità, l'efficienza traslazionale e ridurre il riconoscimento immunitario innato dell'mRNA da parte dei recettori toll-like (TLR) e di altri sensori immunitari, riducendo al minimo l'attivazione immunitaria indesiderata. Ciò impedisce risposte infiammatorie indesiderate, migliorando così la stabilità e l'efficacia dell'mRNA terapeutico nelle cellule umane.
Scoperta precoce e struttura Cap0
A metà degli anni '70, la ricerca sull'mRNA eucariotico ha scoperto una struttura terminale 5' ora nota come Cap0, dove un cappuccio di N7-metilguanosina (m7G) è attaccato al primo nucleotide all'estremità 5'. Si è scoperto che questa modifica protegge l'mRNA dalla degradazione da parte delle esonucleasi, aiuta nell'esportazione nucleare e promuove il riconoscimento del ribosoma per l'inizio della traduzione. Cap0 è stata la prima struttura del cappuccio caratterizzata, con la sua metilazione limitata al cappuccio di guanosina stesso. La scoperta di questo cappuccio 5' e delle sue funzioni ha segnato una svolta significativa nella comprensione dei cappucci dell'mRNA eucariotico e del loro ruolo nelle modifiche dell'mRNA.
L'emergere di Cap1
La struttura Cap1, una caratteristica critica dell'mRNA eucariotico, svolge un ruolo fondamentale nella stabilità dell'mRNA, nella traduzione e nel riconoscimento immunitario. La struttura cap dell'mRNA, costituita da una N7-metilguanosina (m7G) legata al primo nucleotide tramite un legame trifosfato 5'-5', si è evoluta dai primi studi sulle modifiche post-trascrizionali dell'mRNA eucariotico negli anni '70.
Struttura degli mRNA con cappuccio all'estremità 5'.【1】 Ulteriori indagini hanno rivelato che nella maggior parte degli mRNA eucariotici, il primo nucleotide dopo il cappuccio (posizione +1) è anche metilato nella posizione 2'-O del ribosio, un processo noto come 2'-O-metilazione. Questa scoperta, nota come struttura Cap1 (m7GpppNm), ha aggiunto un altro livello di significato funzionale alle modifiche dell'mRNA. Si è scoperto che la modifica Cap1 ottimizza la stabilità dell'mRNA e impedisce il riconoscimento immunitario da parte del sistema immunitario innato, in particolare nelle cellule dei mammiferi, dove aiuta a eludere il riconoscimento da parte dei recettori di riconoscimento dei pattern come RIG-I, TLR e MDA5【2】. Ciò è stato fondamentale sia per il metabolismo dell'mRNA sia per il progresso delle tecnologie basate sull'mRNA, tra cui la vaccinazione con mRNA e le applicazioni di terapia genica.
Sfide tecniche nel settore dell'mRNA e soluzioni attuali
Rimangono diverse sfide tecniche nell'applicazione diffusa e nell'ottimizzazione dei vaccini a mRNA, tra cui problemi con mRNA ad alto dosaggio, risposte immunitarie, stabilità e somministrazione. Una sfida significativa nel settore dell'mRNA è la necessità di dosi elevate di mRNA per suscitare una risposta immunitaria robusta. Ciò è dovuto a diversi fattori:
Degradazione rapida: L'mRNA è intrinsecamente instabile e suscettibile alla degradazione da parte degli enzimi decapsulatori e delle ribonucleasi (RNasi) presenti nei sistemi biologici.
Efficienza traslazionale limitata: L'efficienza con cui l'mRNA viene tradotto in proteina può variare, richiedendo quantità maggiori di mRNA per generare livelli di antigene sufficienti per una risposta immunitaria. L'efficienza della traduzione è correlata all'affinità di Cap1 e al fattore di inizio della traduzione eIF4E.
La formazione del complesso di inizio della traduzione di base negli eucarioti.【3】
Immunogenicità e reazioni immunitarie indesiderate: Il terzo ostacolo più grande è la risposta immunitaria innata che può essere innescata dall'mRNA stesso, specialmente per dsRNA o mRNA incompleto. Mentre un certo livello di attivazione immunitaria è desiderato per stimolare il sistema immunitario adattativo, un'attivazione eccessiva può portare a risposte infiammatorie, che possono ridurre l'efficacia del vaccino o causare effetti collaterali.
Storia della tecnologia di tappatura
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Tecnologia di tappatura enzimatica: Il capping enzimatico, introdotto nei primi giorni della ricerca sull'mRNA, prevede l'uso di enzimi di capping come la guanylyltransferasi e la metiltransferasi per aggiungere un cap naturale 5' post-trascrizionalmente. Questo metodo garantisce un'elevata fedeltà ed efficienza di capping nella traduzione dell'mRNA, in particolare per applicazioni terapeutiche.
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Analoghi di tappi sintetici (anni '80-2000): I ricercatori hanno sviluppato analoghi di cap sintetico per la sintesi in vitro di mRNA cappato, aiutando a studiare la funzione dell'mRNA e l'espressione genica. L'Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) è un analogo di cap sintetico progettato per prevenire l'incorporazione errata del cap durante la sintesi dell'mRNA, migliorando l'efficienza di traduzione dell'mRNA per vaccini e terapie geniche. Tuttavia, l'efficienza di capping e la resa del capping ARCA sono basse.
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Tecnologia Cap1 (anni 2010): Metodo di capping co-trascrizionale Cap1 che semplifica il processo incorporando il cap direttamente durante la sintesi di mRNA. Questo metodo aumenta l'efficienza e produce un'alta percentuale di mRNA correttamente cappato, rendendolo ideale per applicazioni terapeutiche su larga scala come i vaccini a mRNA.
Attualmente, le tecnologie di capping enzimatico sono state fondamentali nello sviluppo di terapie basate sull'mRNA, compresi i vaccini contro il COVID-19, garantendo la stabilità e l'efficace traduzione dell'mRNA terapeutico.
Confronto tra la tappatura enzimatica, la prossima generazione LZCap Capping e il metodo Capping di prima generazione (ARCA)
Sviluppo di analoghi di tappi di nuova generazione
Abbiamo mirato a sviluppare analoghi di cap con resistenza agli enzimi decappanti, elevata affinità a eIF4E per migliorare l'efficienza della traduzione e minore immunogenicità. Questi progressi sono cruciali per migliorare l'efficacia delle terapie basate su mRNA, inclusi i trattamenti antitumorali e le applicazioni di terapia genica.
Progettazione di LZCap
Nella progettazione di LZCap, ci siamo concentrati principalmente sulla creazione di un analogo del cap con elevata affinità per eIF4E. Gli enzimi hanno un riconoscimento relativamente "specifico" dei substrati. Pertanto, quando progettiamo una nuova struttura del cap, ci sforziamo di mantenere il più possibile la somiglianza con le strutture naturali/note. La struttura naturale ha un ribosio 3' OH, che può essere modificato (ad esempio, metilazione). Sulla base di questa considerazione, abbiamo scelto di aggiungere un atomo di carbonio nella posizione 3' per novità, seguito da un NH per imitare il legame idrogeno di OH, e quindi un gruppo acetile per ridurre la basicità di NH e migliorare la sua capacità di legame idrogeno. L'attività di LZCap è migliore del cap naturale metilato, probabilmente a causa dell'aumento del legame idrogeno. Rispetto ai gruppi metile e metossi, il gruppo acetile amminico può anche aumentare le interazioni di van der Waals tra il substrato (cap) e il fattore di inizio (enzima).
Stabilità del gruppo acetil-ammino
Il gruppo acetilamino è già sufficientemente stabile. È molto più stabile della posizione 7-metilata e del legame fosfodiesterico, che sono le parti meno stabili del cappuccio.
Resa ed efficienza di tappatura di LZCap
Con il cappuccio LZCap AG(3'Acm), l'efficienza di capping dell'mRNA della luciferasi è di circa il 97,59% e fino a 200 μg di mRNA cappato possono essere ottenuti con 1 μg di stampo di DNA in una reazione di trascrizione in vitro (IVT) standard con RNA polimerasi T7. La purezza dell'mRNA è fino al 99% dopo una semplice precipitazione con LiCl. Questa elevata efficienza di capping e resa rendono LZCap un'opzione interessante per varie applicazioni, tra cui la produzione di proteine e la terapia genica.
La struttura Cap è una componente essenziale nello sviluppo di vaccini e terapie a mRNA.La tecnologia mRNA sintetica si basa su Cap1 per migliorare la stabilità, l'efficienza traslazionale e ridurre il riconoscimento immunitario innato dell'mRNA da parte dei recettori toll-like (TLR) e di altri sensori immunitari, riducendo al minimo l'attivazione immunitaria indesiderata. Ciò impedisce risposte infiammatorie indesiderate, migliorando così la stabilità e l'efficacia dell'mRNA terapeutico nelle cellule umane.
| Prodotto | berretto AG (3'-LoMe-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (senza limite) |
| Resa di mRNA (microgrammi) | 164 | 173 | 200 |
Analisi MS dell'efficienza di capping dell'mRNA della Luciferasi LZCapped con metodo basato su RNAse H. L'efficienza di capping è di circa il 97,59%,
Com'è la stabilità dell'mRNA nei confronti dell'enzima decappaggio?
Gli mRNA con LZCap AG (3'Acm) e LZCap AG M6 (3'Acm) mostrano una maggiore resistenza all'enzima decappaggio (NEB). Si nota che anche CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) è resistente all'enzima decappaggio, ma il normale Cap AG (3'-OMe-7mG) non mostra resistenza.
Qual è l'affinità di legame di LZCap con eIF4E?
Che dire dell'espressione proteica dell'mRNA bloccato con LZCap AG(3'Acm)?
L'espressione dell'mRNA della luciferasi cappata LZCap AG(3'Acm) è significativamente più alta di quella dell'mRNA cappata dell'analogo Cap1 (3'-OMe-7mG) in diverse linee cellulari* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T e Huh7). L'esperimento di 130 ripetizioni ha mostrato un'espressione dell'mRNA della luciferasi cappata LZCap AG(3'Acm) circa 1,5 volte più alta rispetto all'mRNA cappata (3'-OMe-7mG) in media. Un risultato simile è stato osservato nei topi. Il livello di espressione proteica può variare leggermente con diverse sequenze di mRNA.
Hai altri dati sugli animali?
L'efficienza di espressione di LZCap AG (3'Acm) o LZCap AG (3'FMom) tappato
L'mRNA codificante GLuc mostra un'espressione in vivo più elevata rispetto agli mRNA con cappuccio CapAG (3'-OMe-7mG) nella scimmia Cynomolgus e nel maiale.
Che dire dell'immunogenicità innata degli mRNA bloccati con LZCap AG?
Gli mRNA LZCapAG ( 3'Acm ) cappati mostrano una bassa immunogenicità innata. TLR8, TLR7, IL-1A e B svolgono un ruolo importante nella risposta immunitaria indotta da RNA non cappato. Gli studi in vivo dell'analisi dell'immunogenicità dell'mRNA LZCapped hanno mostrato che l'RNA non cappato ha causato cambiamenti significativi nel livello di trascrizione dei fattori correlati al sistema immunitario nei topi. Sia gli mRNA LZCap che quelli 3'-OMe-7mG cappati mostrano un livello di trascrizione del fattore immunitario inferiore simile nei topi dopo una singola iniezione stimolata da RNA.
Hai fatto qualche test di sicurezza?
Sì, abbiamo eseguito il test di citotossicità, lo studio di inibizione della polimerasi umana e il test di Ames.
- Non si è osservata alcuna o poca citotossicità per il monomero nucleosidico di 3'-Acm-7mG (CC50 > 10000nM) nelle cellule 293T, Huh7, MRC5, THP1 e U87MG.
- DNA polimerasi umana (α,β, γ e Klenow) e gli studi di inibizione dell'attività della RNA polimerasi mitocondriale (hPOLRMT) dimostrano che 3'-Acm-7mG TP non inibisce il DNA o la RNA polimerasi umana.
- Il test di mutazione inversa batterica (Ames) rileva alterazioni genetiche associate, nonché cancerogeni genotossici nella maggior parte dei roditori e degli esseri umani. Il test di Ames ha mostrato che 3'-Acm-7mG non ha genotossicità.
Questo prodotto è stato brevettato?
Sì. Il brevetto è stato concesso negli USA.
Informazioni per l'ordinazione
| Nome del prodotto | Specifiche | Numero di catalogo |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 mM） | 100μL, 1 mL | 10684ES |
| LZCap UA(3'Acm)( 100 millimetri） | 100μL, 1 mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100μL, 1 mL | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100μL, 1 mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)( 25 millimetri） | 100μL, 1 mL | 10689ES |
| Capsula LZ (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100μL, 1 mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-biotina) (25 mM) | 100μL, 1 mL | Richiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL, 1 mL | Richiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL, 1 mL | IOrichiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1 mL | IOrichiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1 mL | IOrichiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL, 1 mL | IOrichiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL, 1 mL | Richiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1 mL | IOrichiesta di informazioni |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1 mL | IOrichiesta di informazioni |
Riferimento:
- Meccanismi molecolari del capping e della metilazione dell'RNA del coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- Vaccini a mRNA: una nuova era nella vaccinologia. Nat. Rev. Droga Scoperta 17, 261–279 (2018).
- Inizio della traduzione regolato dalla proteina legante l'RNA nei mammiferi: la modulazione del complesso di inizio della traduzione da parte di fattori trans-attivi, cellule 2021, 10(7), 1711