Questo articolo descrive l'applicazione della Concanavalina A e il suo accoppiamento covalente con sfere magnetiche.
Parte 1. Concanavalina A
Le perle magnetiche rivestite di Concanavalin A (perle ConA), come suggerisce il nome, sono perle biomagnetiche in cui la lectina vegetale Concanavalin A (ConA) è accoppiata a nanomateriali superparamagnetici. Quella che segue è una breve introduzione alle perle magnetiche ConA.
La concanavalina A (ConA), una proteina lectina vegetale priva di specificità di gruppo sanguigno, è stata la prima proteina lectina vegetale ad essere isolata, purificata e cristallizzata dalla seppia (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) dal 1936.
La ConA ha 2 forme principali a seconda del pH della soluzione in cui è presente: l'omodimero α-2 o l'omotetramero α-4 [2]. In condizioni alcaline (pH>7,0) esiste come tetramero (costituito da quattro subunità di peso molecolare di 26 kDa); in condizioni acide (pH 4,5-5,5) Con A si dissocia in una struttura dimerica attivata (52 kDa). Inoltre, la funzione di ConA è influenzata da cationi bivalenti, ad esempio, in assenza di ioni metallici (Ca2+ e Mn2+), la sua conformazione e la sua funzione di legame con le glicoproteine non possono essere realizzate[1].
Fig. (1). Modellazione molecolare di (A) monomero ConA, (B) dimero ConA, (C) tetramero ConA con mannosio, glucosio e ioni metallici.
Parte 2. Perline
Le sfere biomagnetiche sono una classe di microsfere magnetiche con dimensioni nanometriche delle particelle, formate da polimeri e nanoparticelle magnetiche inorganiche. Le sfere magnetiche possono essere classificate in tre categorie principali in base alla loro struttura: struttura di tipo nucleo-guscio, struttura di tipo sandwich e struttura di tipo diffuso. I materiali magnetici includono polvere di ferro puro, ferro carbonile, minerale magnetico, ortoferrite e lega di ferro e cobalto, e altri.
Nanomateriali magnetici, a causa dei loro effetti speciali, come l'effetto di piccole dimensioni, l'effetto di superficie e l'effetto di dimensione quantistica, ecc., nelle dimensioni di Fe3Lo4 nanoparticelle è inferiore a 30 nm, l'interferenza del disturbo termico all'interno delle nanoparticelle è significativa e, in questo momento, queste nanoparticelle mostrano una speciale proprietà magnetica, ovvero il superparamagnetismo. Fe superparamagnetico3Lo4 Le nanoparticelle sono ampiamente utilizzate nell'industria biologica per le loro proprietà di elevata qualità, come la non tossicità, la buona biocompatibilità, le esclusive proprietà di targeting magnetico e la facilità di generazione di calore in campi magnetici alternati.
Al contrario, l'accoppiamento covalente di ConA con microsfere per l'immobilizzazione di biomolecole presenta i seguenti vantaggi:
- Elevata stabilità del legame di accoppiamento covalente per la riproducibilità;
- Legame del ligando ConA sulla superficie delle microsfere per interazioni con le molecole bersaglio;
- Caratterizzazione cinetica dell'ambiente della soluzione, adatta alla manipolazione sperimentale biologica;
Parte 3. Applicazione delle sfere magnetiche ConA
Come riportato in letteratura, le principali applicazioni delle sfere magnetiche ConA sono suddivise in 3 scenari: la separazione della membrana citoplasmatica, l'arricchimento delle glicoproteine e la separazione degli aspetti cellulari immobilizzati.
Applicazione I: Separazione della membrana citoplasmatica
Utilizzando perle magnetiche ConA influenzate dall'attivazione di cationi bivalenti, in modo che esista in Ca2+ e Mg2+ ambienti di soluzione, che possiedono la funzione di interazione di affinità del terminale α-D-mannosile e α-D-glucosile, utilizzati nella purificazione della membrana plasmatica, sono un modo semplice ed efficiente. Ad esempio, la separazione della membrana plasmatica di cellule o tessuti è un passaggio chiave per ottenere ulteriormente proteine della membrana plasmatica. ConA è in grado di legare proteine glicosilate sulle cellule e questo principio può essere utilizzato per ottenere una membrana plasmatica di purezza più elevata. I principali passaggi operativi sono: immobilizzazione di ConA su sfere magnetiche legando ConA biotinilata a sfere magnetiche di streptavidina; incubazione delle membrane cellulari con sfere magnetiche di ConA per 1 ora; adsorbimento su un rack magnetico; lavaggio con TBS per 5 volte; ed eluizione della soluzione di membrana citoplasmatica con eluente[3].
Fig 2. Fasi di purificazione delle sfere magnetiche ConA per la membrana plasmatica
Applicazione II: Arricchimento delle glicoproteine
ConA è specifico per mannosio e glucosio e riconosce il mannosio α-coniugato, che è il "core oligosaccaride" di molte glicoproteine del siero e della membrana cellulare. Pertanto, può essere utilizzato in immunologia per separare molecole glicosilate come le glicoproteine nei lisati cellulari o tissutali o nel siero.
Una procedura importante era quella mediante cross-linking di nanoperle magnetiche aminosilanizzate (MNP) con ConA tramite un linker bifunzionale, bis-N-idrossisuccinimmide linoleato (DSS), per ottenere perle magnetiche ConA; per terminare il legame non specifico delle nanoperle magnetiche utilizzando metossietilenglicole (MEG) e per effettuare la separazione magnetica; per aggiungere l'estratto delle proteine della membrana cellulare digerite con tripsina per incubare sia le perle magnetiche ConA sia i glicopeptidi catturati e infine per eluire i glicopeptidi catturati e per effettuare l'essiccazione sotto vuoto. Le perle magnetiche ConA sono state entrambe incubate, le perle magnetiche ConA che avevano legato le glicoproteine sono state raccolte dal rack magnetico, i non glicopeptidi sono stati lavati e infine i glicopeptidi catturati sono stati eluiti e essiccati sotto vuoto. Questo metodo consente un'analisi approfondita di siti di glicosilazione specifici di proteine associate al tumore (ad esempio, EGFR)[4].
Fig 3. Nanoparticelle superparamagnetiche accoppiate a diverse lectine
Applicazione III: Isolamento delle cellule immobilizzate
L'uso di sfere magnetiche ConA (sfere magnetiche legate covalentemente alla compagna ad alta purezza Concanavalin A) per legarsi alle glicoproteine sulle membrane cellulari o sulle membrane nucleari, catturando così cellule o nuclei, consente la visualizzazione della manipolazione sperimentale di un piccolo numero di cellule. Ad esempio, le sfere magnetiche ConA sono utilizzate in CUT&Tag e CUT&RUN [5] esperimenti, che sono nuove tecniche utilizzate per studiare la struttura e la funzione della cromatina, e vengono immobilizzati legando le sfere magnetiche ConA alle cellule per visualizzare il funzionamento ed evitare il problema della perdita cellulare causata dalla centrifugazione.
Rispetto alla tradizionale tecnologia ChIP-seq per lo studio delle interazioni DNA-proteine, CUT&Tag e CUT&RUN presentano i seguenti vantaggi:
- Le sfere magnetiche ConA si legano alle glicoproteine della membrana cellulare per visualizzare l'operazione e migliorare l'esperienza dell'operazione sperimentale;
- Non c'è bisogno di centrifugazione, basta che le sfere magnetiche ConA vengano adsorbite sul supporto magnetico per completare la separazione dei campioni cellulari e delle soluzioni;
- Può essere utilizzato con un minimo di 10 celle, evitando così la necessità di un gran numero di campioni per ChIP-seq.
Fig 4. Diagramma schematico del flusso dell'esperimento ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Parte 4. Perle magnetiche rivestite di concanavalina A YEASEN
Le sfere magnetiche ConA, sviluppate da YEASEN, sono in grado di legarsi a glicoproteine, glicolipidi, polisaccaridi e altre molecole con modifica della glicosilazione in modo rapido, efficiente, sensibile e specifico dopo una rigorosa selezione delle materie prime e un'ottimizzazione e un miglioramento multipli dei processi. Sono utilizzate principalmente per l'isolamento cellulare o per l'isolamento di molecole glicosilate come le glicoproteine in lisati cellulari o tissutali o nel siero, e sono utilizzate direttamente in modo particolare per esperimenti come CUT &RUN e CUT&Tag (una tecnologia innovativa per esperimenti ChIP-seq).
1.Caratteristiche del prodotto
- Produzione di lotti stabile e migliore riproducibilità dei risultati;
- Archiviazione stabile delle prestazioni
- Efficienza di cattura delle cellule >90%
2.Informazioni sul prodotto
| Cat N. | Cat#19810ES |
| Misurare | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Colore | Giallo brunastro |
| Concentrazione delle perle | 10 mg/ml |
| Contenuto solido | 9-11 mg/ml |
| Misura della perla | 1 micron |
| Capacità | 105 cellule/µL perle |
3. Dati sulle prestazioni del prodotto
(1)Monodispersione
Nelle stesse condizioni di trattamento e con un ingrandimento di 10×/40×, le sfere di ConA erano sostanzialmente monodisperse e non è stata osservata alcuna agglomerazione evidente rispetto al concorrente.
| Perle di materia prima YEASEN | Perline del concorrente ConA | Perline YEASEN ConA (Cat. n. 19810) |
Figura 5. Grafico dei risultati della monodispersità
(2)Effetto del legame delle perle ConA alla cellula
Lo stesso numero di cellule è stato incubato con le perle per lo stesso periodo di tempo e il numero di cellule rimanenti dopo la coniugazione delle perle ConA è stato rilevato automaticamente dall'analizzatore cellulare e i risultati hanno mostrato che YEASEN Le perle ConA (Cat#19810) hanno superato le prestazioni dei prodotti della concorrenza.
| Sospensione cellulare | Cellule rimanenti dopo il legame delle sfere magnetiche competitive ConA | Cellule rimanenti dopo il legame di YEASEN Perline magnetiche ConA |
Figura 6.Immagine delle cellule legate a sfere magnetiche ConA
(3)Numero di legame cellulare e ripetibilità
Entrambi i 10µL YEASEN Le ConA Beads (Cat#19810) e le ConA Beads da 10µL del competitor, legano numeri di cellule di livello E7 paragonabili al competitor. La cattura cellulare è stata >90% in operazioni ripetute.
Figura 7. I risultati delle perle ConA che legano il numero di cellule e il tasso di cattura
(4)Stabilità in accelerazione
Distribuire a 1 mL/provetta. Le condizioni di conservazione erano: trattamento accelerato a 4℃, 37℃ per 2, 4, 7, 11 e 14 giorni e trattamento di distruzione a -20℃ per 1, 3, 6 e 8 giorni. I risultati hanno mostrato che nelle stesse condizioni sperimentali: il tasso di cattura cellulare dei prodotti conservati a 4℃, trattamento accelerato a 37℃ e trattamento di distruzione a -20℃ era >95% e il valore CV dei tre gruppi di repliche in ciascuna condizione di trattamento era entro l'1%, il che ha mostrato una buona riproducibilità.
Fig 8. I risultati della velocità di cattura cellulare e della ripetibilità delle perle ConA a diverse temperature e tempi
Informazioni per l'ordinazione
| 19810ES |