L'essenza della quantificazione della libreria NGS è la quantificazione degli acidi nucleici (DNA o RNA). Un'analisi accurata della quantificazione della libreria NGS è fondamentale per ottenere dati di sequenziamento di alta qualità. Se la concentrazione quantitativa della libreria NGS è elevata, la resa dei dati di sequenziamento potrebbe essere bassa a causa di un clustering insufficiente. Tuttavia, una bassa concentrazione quantitativa potrebbe causare interferenze di segnale tra cluster per produrre dati di bassa qualità e persino portare a un fallimento del sequenziamento. Inoltre, con l'aumento del flusso di sequenziamento dei sequenziatori, più librerie NGS vengono spesso combinate per il sequenziamento. In base ai requisiti della dimensione dei dati di sequenziamento, le librerie NGS con quantità molari corrispondenti vengono mescolate in base ai risultati quantitativi per stabilizzare l'output della dimensione di ciascun dato campione. Pertanto, un'accurata quantificazione della libreria NGS delle librerie è fondamentale.

Attualmente, ci sono due metodi principali di quantificazione della libreria NGS, il metodo di assorbimento ultravioletto e il metodo del colorante fluorescente. NanoDrop è uno strumento di quantificazione del DNA progettato in base al principio di assorbimento ultravioletto; Qubit è uno strumento di quantificazione del DNA sviluppato secondo il principio del colorante fluorescente. L'accuratezza quantitativa e il costo di questi due metodi sono diversi. Il metodo qubit è principalmente raccomandato qui. Quindi perché ti consigliamo il qubit? Quali sono le caratteristiche dei prodotti Qubit forniti da Yeasen? Continua a leggere...

1. Perché ti consigliamo Qubit?

2. Quali sono le caratteristiche dei prodotti Qubit forniti da Yeasen?

• Come funziona Qubit?
• Prodotto popolare fornito da Yeasen
• Caratteristiche del prodotto

3. Come scegliere Qubit per diversi campioni?

1. Perché ti consigliamo Qubit?

Non c'è dubbio che Qubit sia migliore di Nanodrop. Quindi perché qubit è migliore di nanodrop? Qual è la differenza tra qubit e nanodrop? Innanzitutto, come accennato in precedenza, differiscono nel principio di quantificazione del DNA, NanoDrop è progettato in base all'assorbimento ultravioletto. Il principio del metodo di assorbimento ultravioletto è che ci sono basi puriniche e pirimidiniche nei componenti degli acidi nucleici e queste basi hanno doppi legami coniugati. C'è un forte assorbimento della luce a 250-280 nm nella regione UV e il valore massimo di assorbimento è di circa 260 nm. Pertanto, l'assorbimento UV dell'acido nucleico può essere utilizzato per la quantificazione della concentrazione. NanoDrop è semplice e veloce da usare, ma non riesce a distinguere tra DNA, RNA, acidi nucleici degradati, nucleotidi liberi e altre impurità. Non è adatto per ottenere dati quantitativi accurati della libreria. Tuttavia, la quantificazione Qubit è la scelta migliore per una quantificazione accurata della libreria NGS, in particolare per la quantificazione del DNA. Quindi quali sono le caratteristiche della quantificazione del DNA qubit? Si prega di visualizzare la seguente tabella:

2. Quali sono le caratteristiche dei prodotti Qubit forniti da Yeasen?

Prima di introdurre le caratteristiche dei prodotti Qubit forniti da Yeasen, cerchiamo di capire come funzionano.

2.1 Come funziona Qubit?

Il principio di Qubit è quello di utilizzare coloranti fluorescenti per legarsi alle molecole di DNA per emettere fluorescenza, e quindi misurare l'intensità della fluorescenza per ottenere la concentrazione di acido nucleico. I coloranti fluorescenti fluorescono solo dopo essersi legati al doppio filamento di DNA, e la fluorescenza risultante è proporzionale alla concentrazione di DNA.

2.2 Prodotto popolare fornito da Yeasen

IL Kit di analisi 1×dsDNA HS per Qubit® (Cat#: 12642ES), sviluppato sulla base del dsDNA HS Assay Kit per kit Qubit® (Cat#: 12640ES), è una soluzione premiscelata Qubit pronta all'uso per prediluire i coloranti concentrati nel kit originale in una soluzione di lavoro. Durante l'uso, è necessario solo miscelare il liquido di lavoro con il campione da testare per determinare la concentrazione del campione tramite il fluorimetro Qubit®, che è più comodo da usare.

2.3 Caratteristiche del prodotto

Semplice e facile da usare: liquido premiscelato pronto all'uso, non c'è bisogno di preparare il liquido di lavoro, funzionamento semplice, risparmio di tempo;

Figura 1. I processi del kit di analisi dsDNA HS per Qubit

Sensibilità ultra elevata: quantificazione precisa con diluizione a gradiente 64x, 0,2-100 ng di dsDNA hanno una buona relazione lineare;

Super specificità: rilevamento specifico del dsDNA, eccellente tolleranza ad alcuni inquinanti convenzionali;

Elevata velocità di legame del colorante: la saturazione può essere raggiunta entro 2 minuti, quindi non è necessario attendere una rapida lettura di risultati quantitativi accurati;

Elevata stabilità: il segnale di fluorescenza è durato 3 ore e l'accuratezza quantitativa non è stata influenzata dopo 20 giorni a temperatura ambiente.

Figura 1. Il test di stabilità del prodotto. I risultati mostrano che rimane stabile dopo essere stato conservato a temperatura ambiente per 2 settimane (la deviazione tra il valore misurato e il valore teorico era <10%)

Nota: sono state selezionate due concentrazioni di dsDNA e sono state utilizzate Thermo#Q33230 conservata a 4℃, Yeasen#12642 conservata a 4℃ e Yeasen#12642 conservata a temperatura ambiente (circa 25℃) per determinare i valori di concentrazione in momenti diversi ed è stato calcolato il tasso di deviazione tra ciascuna misurazione e la prima (indicato come 0d).

Figura 2. Test di stabilità del prodotto. Super stabilità, elevata pertinenza dei risultati del test entro il periodo di validità

3. Come scegliere Qubit per diversi campioni?

Qubit, quantificazione veloce! Utilizzare Qubit per la quantificazione delle librerie ha molti vantaggi. Il suo processo di rilevamento è veloce ed efficace.I risultati del sequenziamento possono essere ottenuti in pochi secondi per un singolo campione e la concentrazione può essere direttamente emessa, il che è molto intuitivo. Allo stesso tempo, può anche essere compatibile con la maggior parte degli strumenti di etichettatura enzimatica per la quantificazione di campioni in batch, che è la prima scelta per la quantificazione convenzionale della libreria e la quantificazione dsDNA.