Il Center for Drug Evaluation (CDE) della National Medical Products Administration ha chiaramente affermato nelle sue linee guida per i prodotti di terapia genica che è necessario controllare la quantità di residui di DNA e la dimensione dei frammenti residui, raccomandando che la dimensione dei frammenti residui di DNA sia controllata al di sotto di 200 bp il più possibile. Pertanto, la rimozione degli acidi nucleici residui nei prodotti biofarmaceutici è estremamente importante. Con la crescente complessità dei processi di produzione, la rimozione efficace degli acidi nucleici residui in ambienti ad alto contenuto di sale si scontra con numerose nuove sfide:
- Durante il processo di purificazione dei virus AAV, per migliorare il recupero del virus, vengono spesso utilizzati tamponi con concentrazioni saline più elevate (200-500 mM). Tuttavia, le nucleasi convenzionali mostrano una significativa diminuzione dell'attività con l'aumento della concentrazione salina. Se l'effetto di purificazione deve essere migliorato aumentando la quantità di enzima e il tempo di incubazione, ciò aumenterà notevolmente i costi
- Il DNA ospite di solito esiste sotto forma di cromatina ed è facilmente incapsulato dalle proteine, rendendo il DNA inaccessibile. In ambienti ad alto contenuto di sale, gli acidi nucleici e le proteine possono separarsi efficacemente, rimuovendo così meglio gli acidi nucleici residui
- I vettori virali come l'AAV possono aggregarsi a causa di interazioni elettrostatiche, e questa aggregazione è più probabile che si verifichi in condizioni di bassa forza ionica e DNA residuo, portando a una stabilità ridotta e influenzando la resa. L'aumento della concentrazione di sale può ridurre efficacemente l'aggregazione delle particelle del virus AAV, migliorando il tasso di recupero delle particelle del virus AAV
Salt Active UltraNuclease (nucleasi ad ampio spettro tollerante al sale) è un'endonucleasi non specifica ricombinante derivata da microrganismi marini. Rispetto a UltraNuclease, mostra un'attività ottimale a una concentrazione di sale di 500 mM e può rimuovere efficacemente la contaminazione da acido nucleico anche in ambienti ad alto contenuto di sale.
Scenari di applicazione del prodotto
- Rimozione degli acidi nucleici residui nei prodotti biologici: durante la produzione di prodotti biologici, come virus, vaccini e proteine, è possibile aggiungere UltraNuclease per degradare gli acidi nucleici residui. Questo passaggio non solo aumenta la resa dei virus, ma riduce anche significativamente il contenuto di acidi nucleici residui, garantendo così la sicurezza e l'efficacia dei farmaci.
- Riduzione della viscosità: degradando gli acidi nucleici, si riduce la viscosità dei lisati cellulari, facilitando i processi di filtrazione/ultrafiltrazione durante la purificazione di particelle derivate dalle cellule, come virus, vettori AAV e corpi di inclusione.
- Risoluzione e recupero migliorati: nelle analisi ELISA, elettroforesi bidimensionale e immunoblotting, migliora la risoluzione e il recupero.
- Prevenzione dell'aggregazione cellulare: UltraNuclease può prevenire efficacemente l'aggregazione delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC).
Test delle prestazioni del prodotto
L'effetto dell'ambiente ad alto contenuto di sale sull'attività enzimatica (Na+)
Per abbinare l'uso di Salt Active UltraNuclease, Yeasen ha anche sviluppato in modo indipendente uno specifico kit di rilevamento per Ultranucleasi attiva al sale, che può rilevare efficacemente i residui enzimatici e ridurre i rischi. Il kit Salt Active UltraNuclease ELISA è stato sviluppato e prodotto secondo le linee guida di convalida del metodo analitico <9101> della Farmacopea cinese del 2020, rispettando rigorosamente i requisiti chiave per i test multiparametrici (intervallo lineare, specificità, accuratezza, precisione, sensibilità, stabilità accelerata, ecc.).
A questo scopo, Yeasen Biotech ha sviluppato un kit ELISA per la rilevazione di Salt Active UltraNuclease. Il kit utilizza il principio del test immunoenzimatico a sandwich di anticorpi (ELISA) per rilevare la quantità residua di UltraNucleasi attiva al sale. I campioni standard e di prova di UltraNucleasi attiva al sale vengono aggiunti alla piastra rivestita con enzima pre-rivestita con anticorpo anti-UltraNucleasi attiva al sale (36703-A). Quindi, viene aggiunto l'anticorpo di rilevamento della nucleasi marcato con biotina diluito (36703-C), seguito da Streptavidina-HRP (SA-HRP) (36703-D). Ciò forma un complesso anticorpo + antigene + anticorpo-biotina + SA-HRP. Dopo aver lavato la piastra, viene aggiunta la soluzione di substrato TMB (36703-H) per lo sviluppo del colore. Sotto la catalisi dell'enzima HRP, TMB cambia da incolore a blu e infine diventa giallo sotto l'azione della soluzione di arresto (36703-I). L'intensità del colore giallo è direttamente proporzionale alla quantità di nucleasi universale altamente tollerante al sale rilevata nel campione.
Processo sperimentale di rilevamento della Salt Active UltraNuclease residua mediante il kit Salt Active UltraNuclease ELISA.
Caratteristiche del kit UltraNuclease e Salt Active UltraNuclease ELISA:
Conformità normativa: Completamente convalidato secondo i requisiti normativi, sono disponibili report di convalida;
Garanzia di qualità: Tutte le materie prime per il kit sono sviluppate in modo indipendente, garantendo una qualità controllabile;
Alta sensibilità: Limite quantitativo basso fino a 23 pg/mL;
Alta precisione: Elevata ripetibilità intra-lotto e bassa variabilità inter-lotto;
Forte specificità: Nessuna reattività crociata con altre proteine cellulari ingegnerizzate
Parametri di prestazione
| Parametri del prodotto | contenuto |
| Tempo di analisi | 3,5 ore |
| Principio di analisi | Test immunoenzimatico a due siti |
| Amplificazione del segnale | Sistema biotina-streptavidina |
| Lunghezza d'onda di rilevamento | 450nm e 630nm |
| Sensibilità | 0,024 ng/ml |
| Campo di rilevamento | 0.047 ng/ml~3 ng/ml |
| Oggetto di rilevamento | Ultranucleasi attiva al sale |
| Strumento applicabile | Dispositivi molecolari: serie M e i |
| Applicazione | Rilevamento di Nucleasi residua nei processi di purificazione di vaccini cellulari e genici e di vaccini virali adeno-associati ricombinanti |
Dati del prodotto:
Curva standard del kit reagente:
Specificità
La cross-reattività tra l'anticorpo Salt Active UltraNuclease e le sette proteine nel kit è stata valutata utilizzando questo kit per rilevare le proteine aggiunte nei sette processi. Sono stati impostati un controllo positivo (PC-0,047 ng/mL) e un controllo negativo (NC-0 ng/mL).
I risultati hanno mostrato che la proteina aggiunta nei 7 processi era vicina al controllo negativo (NC-0 ng/mL), la concentrazione di rilevamento era inferiore al limite di quantificazione di questo kit (0,047 ng/mL) e non si è verificata alcuna reazione crociata. osservato.
Sluccio Tasso di recupero:
Aggiungere tre standard di concentrazione (vale a dire, Std1 3 ng/mL, Std3 0,75 ng/mL e Std5 0,188 ng/mL) in proporzioni uguali ai due campioni forniti dal cliente per l'esperimento di recupero dello spike. I risultati mostrano che i tassi di recupero dello spike sono tutti compresi tra l'80% e il 120%. Tasso di recupero dello spike % = (valore misurato del campione spiked - valore misurato del campione non spiked) / valore teorico (quantità di standard aggiunto) * 100%.
| Nome del campione | Concentrazione di prova di UltraNucleasi Attiva al Sale (ng/mL) | Quantità di standard (ng/mL) | Risultato del test (ng/mL) | Tasso di recupero dei picchi (%) |
| TS1 | 0,04 | 3 | 1.71 | 114,00% |
| 0,75 | 0,347 | 92,53% | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43% | ||
| TS2 | 0,08 | 3 | 1.772 | 118,13% |
| 0,75 | 0,405 | 108,00% | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64% |
Precisione
1) Ripetibilità
Sono stati selezionati tre prodotti standard Salt Active UltraNuclease con concentrazione alta, media e bassa per esperimenti ripetuti. Nello stesso esperimento, i campioni di ciascuna concentrazione sono stati testati per 10 volte e CV%< 10%.
| Differenza in batch | |||
| Concentrazione teorica (ng/mL) | Numero di ripetizioni | Media (ng/mL) | Coefficiente di variazione CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2,97% |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2,27% |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56% |
2) Precisione intermedia
Sono stati utilizzati diversi lotti di kit per 3 esperimenti, ogni esperimento è stato eseguito con 3 concentrazioni di alta, media e bassa e ogni concentrazione è stata ripetuta 10 volte. Sono stati ottenuti 30 dati in totale da ogni punto di concentrazione e il CV% di ogni concentrazione era inferiore al 15%.
| Differenza di lotto | |||
| Concentrazione teorica (ng/mL) | Numero di esperimenti | Media (ng/mL) | Coefficiente di variazione CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1.423 | 5,70% |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59% |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6,82% |
Informazioni sul prodotto
| Nome del prodotto | Prodotto numero | Specifiche del prodotto |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36703ES96 | 96T |
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