Il kit di analisi dei frammenti di DNA residuo delle cellule ospiti HEK293 è progettato per analisi quantitativa di frammenti di DNA residuo HEK293 di varie lunghezze in prodotti intermedi, semilavorati e prodotti finali di preparazioni biologiche. Questo kit utilizza il principio della sonda di fluorescenza qPCR per rilevare in modo specifico e rapido i residui di DNA HEK293 sia al di sotto che al di sopra di 200 coppie di basi, con un limite di quantificazione basso quanto 10 fg/μL. Include anche il controllo del DNA HEK293 (riferimento quantitativo del DNA). Questo kit può essere utilizzato insieme ai kit di preparazione dei campioni di DNA residuo basati su biglie magnetiche dell'azienda (Cat#18461ES/18462ES).

Informazioni sul prodotto

Componente

Conservazione e spedizione:

1. Tutti i componenti vengono spediti in ghiaccio secco e devono essere conservati a una temperatura compresa tra -25°C e -15°C al momento della ricezione. La durata di conservazione è di 2 anni. I componenti A e B1, B2, B3 e B4 devono essere conservati al riparo dalla luce.

2. Al ricevimento, verificare che siano presenti tutti e 7 i componenti e conservarli immediatamente alle temperature consigliate.

Precauzioni:

1. Questo prodotto è destinato esclusivamente a scopi di ricerca.

2. Per motivi di sicurezza e salute, durante il funzionamento si prega di indossare camici da laboratorio e guanti monouso.

3. Prima di utilizzare questo reagente, leggere attentamente il manuale di istruzioni. Gli esperimenti devono essere condotti seguendo le procedure standard, tra cui la manipolazione del campione, la preparazione delle miscele di reazione e il pipettaggio.

4. Ogni componente deve essere miscelato accuratamente agitando delicatamente e centrifugato brevemente prima dell'uso.

Strumenti compatibili:

Inclusi, ma non limitati ai seguenti strumenti: Termo Scientifico: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: Modulo ottico CFX96, Tecnologia medica di Shanghai Hongshi: SLAN-96S

Istruzioni per l'uso

1. Diluizione del riferimento quantitativo di controllo del DNA HEK293 e preparazione delle curve standard

Il kit di analisi dei frammenti HEK293 include quattro frammenti di amplificazione di diverse lunghezze: 82 bp, 133 bp, 227 bp e 515 bp. Quando si stabiliscono le curve standard, impostare curve separate per ciascun frammento di amplificazione e calcolare le loro quantità residue e le relative distribuzioni in base alle corrispondenti curve standard.

Utilizzare il DNA Dilution Buffer fornito nel kit per eseguire una diluizione a gradiente del DNA Control Quantitative Reference HEK293. Le concentrazioni di diluizione devono essere: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL e 30 fg/μL.

I dettagli sono i seguenti

1). Mettere il controllo del DNA HEK293 e il tampone di diluizione del DNA dal kit su ghiaccio per scongelarli. Dopo lo scongelamento completo, agitare delicatamente per mescolare e centrifugare brevemente (10 secondi) per raccogliere la soluzione sul fondo della provetta.

2)Preparare sei provette da centrifuga pulite da 1,5 ml ed etichettarle come Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 e Std5.

3). Nella provetta etichettata Std0, aggiungere 90 μL di DNA Dilution Buffer e 10 μL di HEK293 DNA Control per ottenere una concentrazione di 3 ng/μL. Agitare delicatamente per mescolare e centrifugare brevemente (10 secondi). Questa concentrazione può essere suddivisa in aliquote e conservata a -20°C per un uso a breve termine (fino a 3 mesi). Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.

4). Nelle provette etichettate Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 e Std5, aggiungere prima 90 μL di DNA Dilution Buffer a ciascuna. Ogni fase di diluizione deve essere miscelata delicatamente e centrifugata brevemente per garantire l'uniformità. Quindi esegui il gradiente diluizioni come segue:

Tabella 1: Diluizione del gradiente standard

* Per ogni concentrazione, eseguire 3 repliche. Questo reagente può testare entro un intervallo lineare da 300 pg/μL a 30 fg/μL. Se necessario, l'intervallo lineare può essere opportunamente esteso o ristretto.

** Per ridurre i cicli ripetuti di congelamento-scongelamento ed evitare contaminazioni, si consiglia di aliquotare e conservare la quantificazione del DNA Sstandard a -20°C per il primo utilizzo.

*** La diluizione del DNA non utilizzata e scongelata può essere conservata a 2-8°C per un massimo di 7 giorni. Se non utilizzata per un periodo prolungato, conservarla a -20°C.

**** Per garantire la completa miscelazione del modello, agitare delicatamente ogni diluizione del gradiente per circa 1 minuto.

2. Preparazione del campione di prova (TS)

Preparare il campione di prova TS in base all'impostazione dell'esperimento, come segue:

1) Prendi 100 μL del campione di prova e aggiungili a una provetta da centrifuga pulita da 1,5 mL. Etichettala come TS, esegui il pretrattamento del campione e prepara tlo Purificaree il campione di prova.

2) Per soddisfare il requisito di analisi simultanea di quattro diverse lunghezze di estensione, la quantità di campione di prova pretrattato deve essere ≥120 μL. Pertanto, si consiglia di preparare 2 provette di ciascun campione per il pretrattamento e, dopo l'estrazione, mescolarle insieme per l'uso.

3. Preparazione del controllo di estrazione negativo (NCS)

Preparare il controllo di estrazione negativo NCS in base alla configurazione dell'esperimento, come segue:

1) Prendere 100 μL della soluzione di matrice del campione (o diluizione del DNA respingente) e aggiungerlo a una provetta da centrifuga pulita da 1,5 mL. Etichettarlo come NCS.

2) Eseguire il pretrattamento del campione di controllo negativo NCS insieme al lotto di campioni di prova e preparare la soluzione di controllo negativo NCS purificata.

3) Per soddisfare il requisito di analisi simultanea di quattro diverse lunghezze di estensione, la quantità di campione NCS pretrattato deve essere ≥120 μL. Pertanto, si raccomanda di preparare 2 provette di ciascun campione NCS per il pretrattamento e, dopo l'estrazione, mescolarle insieme per l'uso.

4. Preparazione del controllo senza modello (NTC)

Preparare il controllo NTC senza modello in base all'impostazione dell'esperimento, come segue:

1) Nessun controllo del modello (NTC) non richiede campione pretrattamento, e può essere preparato a partire dalla fase di rilevamento del contenuto di DNA residuo mediante qPCR.

2) Per ogni provetta o pozzetto, il campione NTC è costituito da 20 μL di mix (ovvero, 15 μL di HEK293 qPCR Mix + 5 μL di HEK293 Primer & Probe Mix corrispondente) + 10 μL di DNA Dilution Buffer. Si consiglia di preparare una quantità sufficiente per 3 pozzetti replicati.

5. Sistema di reazione qPCR

Tavolo 2. Sistema di reazione per Frammento di 82 bp

Tavolo 3. Sistema di reazione per 133 frammento bp

Tavolo 4. Sistema di reazione per 227 frammento bp

Tavolo 5. Sistema di reazione per 515 frammento bp

* Per calcolare la quantità totale di Mix richiesta per questa reazione in base al numero di pozzetti:

Miscela = (Numero di pozzetti di reazione + 2) × (15 + 5) μL (per tenere conto della perdita dei 2 pozzetti). In genere, vengono preparati 3 pozzetti replicati per ogni campione.

** Numero di pozzetti di reazione = (5 pozzetti della curva standard del gradiente di concentrazione + 1 controllo senza modello (NTC) + 1 soluzione di controllo negativo (NCS) + N campioni di prova (TS)) × 3.

NTC (No Template Control): tampone di diluizione del DNA

NCS (soluzione di controllo negativo): soluzione di matrice del campione o tampone di diluizione del DNA dopo il pre-campione-trattamento per ottenere la soluzione purificata, che è l'NCS.

TS (Test Sample): il campione da testare.

***Dopo aver distribuito i campioni e sigillato le provette, centrifugare brevemente a bassa velocità (10 sec) per raccogliere il liquido dalle pareti della provetta sul fondo. Quindi agitare per almeno 5 secondi per miscelare accuratamente. In seguito, eseguire un'altra centrifugazione a bassa velocità (10 sec). Se ci sono bolle, assicurarsi di rimuoverle.

Tabella 6: Disposizione della piastra di riferimento

Questo esempio spettacoloè la procedura di rilevamento qPCR per l'analisi dei frammenti di amplificazione del DNA residuo di HEK293.I campioni di prova includono: 5 gradienti di concentrazione della curva standard del DNA HEK293, 1 campione di prova (TS), 1 soluzione di controllo negativo (NCS) e 1 controllo senza modello (NTC). Si consiglia di eseguire 3 pozzetti replicati per ogni campione.

6. Parametri del programma di amplificazione (TtreMetodo in più fasi) (Esempio utilizzando lo strumento ABI 7500 qPCR, versione software 2.0)**

1) Creare un nuovo programma vuoto e selezionare "Quantificazione assoluta" come modello di rilevamento.

2) Per le quattro diverse lunghezze dei frammenti di amplificazione, creare nuove sonde di rilevamento, denominandole "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227"e "HEK293-515". Selezionare il fluoroforo reporter come "FAM" e il fluoroforo quencher come "none". Impostare il colorante di riferimento per il rilevamento come "ROX" (il colorante di riferimento può essere aggiunto o meno a seconda del modello dello strumento e di altri fattori).

3) Nel pannello "Assegna target ai pozzetti selezionati", imposta il campo "Attività" per i pozzetti della curva standard come "Standard" e assegna i valori corrispondenti nel campo "Quantità" come "300000", "30000", "3000", "300", "30" (che rappresenta la concentrazione di DNA per pozzetto, in fg/μL). Assegnare ai pozzetti nel campo "Nome campione" il nome "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". Per i pozzetti NTC, impostare "Task" su "NTC". Per i pozzetti NCS e TS, impostare "Task" su "Sconosciuto" e assegnare ai pozzetti il ​​nome "NCS" e "TS" nel campo "Nome campione". Dopo aver impostato questi parametri, fare clic su "Avvia esecuzione" per avviare l'esecuzione dello strumento.

4) Impostazioni del programma di amplificazione: impostare il programma di amplificazione in tre fasi, con un volume di reazione di 30 μL.

Tavolo7. Procedura PCR

7. Analisi dei risultati qPCR

1) Nel pannello "Analysis" sotto "Amplification Plot", il sistema imposterà automaticamente la "Threshold". A volte, la "Threshold" predefinita è troppo vicina alla linea di base, causando una variazione significativa di Ct tra le repliche. È possibile regolare manualmente la "Threshold" in una posizione appropriata e fare clic su "Analyze". A questo punto, è possibile controllare in via preliminare le curve di amplificazione nel "Multicomponent Plot" per vedere se sono normali.

2) Nel pannello "Analisi" sotto "Curva standard", puoi leggere R², efficienza di amplificazione (Eff%), pendenza e intercetta della curva standard. Per una curva standard normale: R² > 0,99, efficienza di amplificazione (90% ≤ Eff% ≤ 110%) e pendenza tra -3,6 e -3,1.

3) Nel pannello "Analisi" sotto "Visualizza tabella pozzetti", puoi leggere la colonna "Quantità" per il controllo senza modello (NTC), il controllo negativo (NCS) e i campioni di prova (TS), con l'unità in fg/μL. Le unità possono essere convertite più avanti nel report.

4) Le impostazioni dei parametri per l'analisi dei risultati dovrebbero dipendere dal modello specifico dello strumento e dalla versione del software. Di solito, lo strumento può interpretare automaticamente i risultati.

5) Il valore Ct del controllo negativo (NCS) deve essere maggiore del valore Ct medio della concentrazione più bassa della curva standard.

6) Il risultato del controllo senza modello (NTC) deve essere "Indeterminato" o avere un valore Ct ≥ 32.

Documento

Manuale