T4 DNAリガーゼの概要
科学者は新しい遺伝子を結合するためにどの酵素を使用するのでしょうか。言うまでもなく、DNAリガーゼも含まれます。では、なぜDNAリガーゼは組み換えDNAにおいてそれほど重要なのでしょうか。DNAリガーゼは、実験の成功を決定する重要な要素の1つである標的断片をベクターに連結する役割を担っているからです。DNAリガーゼの一種であるT4 DNAリガーゼは、分子クローニング実験においてどのような役割を果たしているのでしょうか。どのように機能するのでしょうか。次に、T4 DNAリガーゼについて詳しく紹介します。
1. T4 DNA リガーゼとは何ですか?
2. T4 DNAリガーゼの機能は何ですか?
3.
4.
1. T4 DNA リガーゼとは何ですか?
T4 DNA リガーゼは、DNA 分子間の連結反応を触媒する ATP 依存性リガーゼです。主に、3'-ヒドロキシル末端と 5'-リン酸末端を結合してホスホジエステルを形成します。DNA リガーゼは、すべての生物の DNA 複製および修復プロセスに関与しています。ファージにコード化された T4 DNA リガーゼは、大腸菌のファージ T4 感染時に生成されます。
遺伝子工学で使用されるリガーゼは主に大腸菌 DNA リガーゼと T4 DNA リガーゼであり、後者は現在より広く使用されています。T4 DNA リガーゼは、二本鎖 DNA、二本鎖 RNA、または DNA/RNA ハイブリッド鎖上の一本鎖の切断を修復して、隣接する 2 つのヌクレオチドを結合することができ、DNA の修復と組み換えにおいて重要な役割を果たします。
組み換えプラスミド構築プロセスでは、T4 DNAリガーゼを制限酵素と併用して組み換えプラスミド構築実験を完了することができます。これは、二本鎖DNAの5'-P末端と3'-OH末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒することができ、粘着末端接続と平滑末端接続に対して優れた接続効率を持っています。
図1. T4 DNAリガーゼのメカニズム
2. T4 DNAリガーゼの機能は何ですか?
2.1 ベクトルの構築
ベクター構築実験では、異なる制限酵素によって異なる種類の末端が生成されます。末端が異なれば、T4 DNA リガーゼのライゲーション戦略も異なります。
2.1.1 制限酵素によるクローニング、単一消化による粘着末端の生成
ベクターの構築中に、同じ制限酵素を使用して標的遺伝子のDNA断片を切断し、ベクター分子が同じ粘着末端を生成できる場合、T4 DNAリガーゼは直接組換え接続を実行できます。ただし、粘着末端が同じであるため、標的遺伝子は順方向または逆方向にベクターに挿入される可能性があり、正しい組換えクローンのスクリーニングの作業負荷が簡単に増加します。ベクターの構築には、二重酵素消化法の使用を検討してください。
また、単一酵素消化によって調製されたベクターの付着末端も対合することができ、その後、T4 DNAリガーゼの作用下でヌクレオチド間にホスホジエステル結合が形成され、ベクターの自己連結が生じる。アルカリホスファターゼを使用して消化されたベクターを処理すると、ベクターの5'末端のリン酸基が除去され、ベクターが自己連結を完了できなくなります。このようにして、T4 DNAリガーゼの作用下で、ベクターと標的断片が接続され、組み換えベクターの構築が完了します。
2.1.2 制限酵素によるクローニング、二重消化による粘着末端の生成
ベクター構築の過程で、異なる粘着末端を持つ2つの制限酵素を使用してそれぞれターゲットフラグメントとベクターを消化すると、2つの異なる粘着末端が生成される可能性があります。この時点で、T4 DNAリガーゼは同じ粘着末端を選択的にライゲーションして、ターゲットフラグメントが正しい方向でベクターに挿入されるようにすることができます。図2のターゲットフラグメントとベクターをEcoR IとBamH Iで同時に消化すると、同じ粘着末端を接続できます。ターゲットフラグメントとベクターの間には、ライゲーション方向が1つしかありません。
図2. 二重酵素消化によって生成された粘着末端ライゲーション[1]
2.1.3 制限酵素断片のクローニング（平滑末端）
Sma Iなどの一部の制限酵素も、酵素切断中に平滑末端を生成する可能性があります。T4 DNAリガーゼは、ベクターとインサートの間にホスホジエステル結合を直接形成することができ、塩基間の対合は必要ありません。ただし、この方法はライゲーション効率が低く、ベクターの自己ライゲーションが発生しやすいです。通常、平滑末端を粘着末端に変換してからライゲーションすることができます。たとえば、ターゲットフラグメントとベクターの末端に相補的なポリA塩基とポリT塩基を追加し、人工的に粘着性のある相補末端をそれぞれ追加すると、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる接続効率が向上します。
2.1.4 TAクローニング
TAクローニングに使用されるTベクターは、3'末端にTオーバーハングを持っています。標的断片のDNA配列が不明な場合は、TAクローニングによって標的遺伝子断片をTベクターに接続し、配列決定によって標的遺伝子を決定することができます。PCRに使用されるTaq DNAポリメラーゼは末端転移酵素活性を持ち、DNA断片の3'末端にヌクレオチド「A」を追加することができます。T4 DNAリガーゼは、Taq DNAポリメラーゼによって増幅された産物をTベクターに直接接続することができ、PCR増幅産物は人工アダプターを追加することなく効率的なクローニングの目的を達成できます。
図3. TAクローニングのワークフロー[2]
2.2 NGSアダプターライゲーション
次世代シーケンシングライブラリの構築中、PCR産物をシーケンシングチップのフローセルに固定してシーケンシングを完了する前に、人工アダプターをPCR産物に接続する必要があります。TAクローニングライゲーションリンカーライブラリ構築は非常に一般的な技術手段であり、その原理は前述のTAクローニングに似ています。シーケンシングするDNA断片の5'末端をリン酸化した後、3'末端に「A」を追加し、「T」粘着末端を持つアダプターと相補的にペアリングします。その後、完全な二重鎖が形成され、機械によってシーケンシングされます。
TA ライゲーション中は、異なるサンプルタイプや核酸フラグメント構造の複雑さがライゲーションの効率に影響を与えるため、異なるプラットフォームのアダプターも最終的なライブラリ結果に影響を与えます。
たとえば、MGI プラットフォームのバブル アダプターは特殊な二次構造を持ち、T4 DNA リガーゼに対して非常に高いライゲーション効率を必要とし、ライゲーション効率の低下はライブラリの出力に直接影響します。
図4. 一般的なアダプターライゲーションプロセス
3. Yeasen Biotech T4 DNAリガーゼはNGSアダプターライゲーションに使用できます
3.1 超高ライゲーション効率を誇るYeasen Biotech Fast T4 DNAリガーゼ
図5. Agilent 2100で検出されたさまざまな種類のライゲーション産物
3.2 優れたライブラリ収量を誇る Yeasen Biotech Fast T4 DNA リガーゼ
さまざまな種類のライブラリ構築に Fast T4 DNA リガーゼを使用すると、他の T4 DNA リガーゼと比較して、ライブラリの収量が向上します。
表1. ライブラリによる各種サンプルの収量
|
サンプルの種類 |
腸内細菌叢 gDNA |
cfDNA |
FFPE HD200 gDNA |
|||
|
T4 DNAリガーゼ （同じ単位） |
イェーセン |
いいえ* |
イェーセン |
いいえ* |
イェーセン |
いいえ* |
|
入力DNA量（ng） |
10 |
10 |
50 |
|||
|
増幅サイクル数 |
10 |
10 |
8 |
|||
|
平均収量（μg） イルミナプラットフォーム |
3.3 |
2.8 |
2.7 |
2.2 |
3 |
2.5 |
|
平均収量（μg） MGIプラットフォーム |
2.7 |
0.9 |
2.0 |
0.7 |
2.3 |
0.8 |
4. Yeasen Biotech T4 DNAリガーゼの選択ガイド
表2: 関連製品
|
製品の位置付け |
製品名 |
猫＃ |
応用 |
|
ユニバーサル |
Hieff™ Gold T4 DNAリガーゼ(お問い合わせ) |
10300ES |
分子クローニング。 |
|
ユニバーサル |
10301ES |
NGS ライブラリの構築。 |
|
|
高いライゲーション効率と低い宿主大腸菌残留物 |
10299ES |
NGS ライブラリ構築。特に病原体検出、NIPT 検出などに適しています。 |
|
|
高感度 |
10298ES |
NGS ライブラリ構築。特に cfDNA サンプルのライブラリ構築に適しています。 |
参考文献
[1] W. Yuan. 遺伝子工学[M]. 化学産業出版社、2019年。
[2] Clark DP、Pazdernik NJ、Mcgehee M R. 合成生物学のための遺伝子のクローニング - ScienceDirect[J]。分子生物学（第3版）、2019：199-239。
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. DNAリガーゼ：構造、反応機構、機能[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] シューマンS. DNAリガーゼ：進歩と展望[J]. 生化学ジャーナル、2009年、284(26):17365-17369。