ウェスタンブロットワークフローでよくある間違いを避ける

I. ウエスタンブロットの原理

ウエスタンブロット (WB) またはタンパク質免疫ブロット法は、抗原抗体相互作用に基づいて特定のタンパク質を検出する古典的な手法で、分子生物学、免疫学、および関連分野で広く利用されています。その主な手順は次のとおりです。

タンパク質分離:

- SDS-PAGE は変性タンパク質を分子量によって分離します。

- SDS はタンパク質を均一な負電荷でコーティングし、構造的影響を排除します。

膜転写：

- タンパク質はゲルから膜（PVDF またはニトロセルロースなど）に転写されます。

抗体検出:

- 一次抗体は標的タンパク質に特異的に結合し、その後、酵素結合二次抗体（HRP など）が化学発光などの検出可能な信号を生成します。

II. 標準的なウェスタンブロットワークフロー

ステップ	主な手順	推奨試薬（イェーセン製品）
1. サンプルの準備	RIPA 溶解バッファーでタンパク質を抽出し、プロテアーゼ活性を阻害するために PMSF を追加します。	RIPA 溶解バッファーシリーズ、PMSF
2. タンパク質の定量	定量化には BCA メソッド ( Cat#20200ES ) を使用し、標準希釈バッファーをサンプルバッファーと一致させます。	BCA 定量キット (カタログ番号 20200ES / 20201ES )
3. SDS-PAGE電気泳動	プレキャストゲルを使用し、染料がゲルの底に達するまで 150 V で流します。	プレキャストゲル、SDS-PAGEローディングバッファー
4. 膜転写とブロッキング	アクティブPVDFメンブレン（カタログ番号36125ES ）メタノールに1分間浸し、氷浴中で300mAで60分間転写し、室温（RT）で1時間ブロックするか、迅速ブロッキング溶液（カタログ番号36122ES ）を10分間使用します。	転写バッファー、PVDFメンブレンシリーズ
5. 抗体のインキュベーション	一次抗体を 4°C で一晩インキュベートし、二次抗体を室温で 1 ～ 2 時間インキュベートし、TBST で 3 回徹底的に洗浄します。	抗体希釈液
6. タンパク質検出	ECL ( Cat#36208ES ) を使用して開発します。	ECL化学発光シリーズ

図1:ウェスタンブロットのワークフロー

III. 一般的な問題と解決策

問題	考えられる原因	ソリューション
高い背景	不完全なブロック	新しいブロッキング溶液を使用し、ブロッキング時間を延長します。
	不十分な洗浄	非特異的結合を除去するには、洗浄頻度と洗浄時間を増やします。
	一次抗体濃度の過剰	抗体を適切な濃度に希釈します。
	サンプル品質の問題	サンプルの純度と品質を確認し、新鮮なサンプルを使用してください。
	膜乾燥	インキュベーション手順中は膜が水和状態を保つようにし、反応溶液と完全に接触するようにします。
信号が弱いまたは信号がない	転送が不完全	転送効率を確認し、必要に応じて時間を調整します。
	非活性PVDF膜	バッファーに移す前に、PVDF をメタノールに浸して活性化します。
	一次抗体と標的種との不一致	データシートを確認し、免疫原とタンパク質の配列を比較し、広く使用されている陽性対照（例：哺乳類細胞のβ-アクチン）。
	一次抗体と二次抗体の不適合	二次抗体が一次抗体の宿主種と一致していることを確認します。
	抗体結合が不十分	抗体濃度を高め、4°C でのインキュベーションを延長します (例: 一晩)。
	抗原レベルが低い	レーンあたり少なくとも 20 ～ 30 μg のタンパク質をロードします。プロテアーゼ阻害剤と陽性コントロールを使用します。
	標的タンパク質の発現が低い	文献/データベースでサンプルの発現を確認します。サンプルを濃縮するか、高発現コントロールを使用します。
非特異的バンド/複数のバンド	過剰継代細胞株がタンパク質プロファイルを変化させる	継代数の少ない細胞（継代数 15 回未満）を使用し、継代数の初期段階のストックと並行してコントロールを実行します。
	タンパク質分解	溶解バッファーにプロテアーゼ阻害剤を含め、-80°C で保存し、凍結融解を避け、新鮮なサンプルを使用します。
	翻訳後修飾	バンドのサイズに影響する変更（例：ユビキチン化、グリコシル化）については文献を確認してください。
	複数のスプライスバリアント	文献またはデータベースを介してスプライスバリアントを確認します。
	タンパク質二量体/多量体	新鮮なβ-メルカプトエタノールまたはDTTをSDSローディングバッファーに追加します。
	外因性タンパク質汚染	外因性タンパク質をチェックし、必要に応じて細胞株を切り替えます。
	過剰なサンプルロード	勾配テストによるターゲット発現に基づいてロード量（20～30 μg）を最適化します。
	多量体形成	サンプルを10分間煮沸して多量体を解離する
	高い一次抗体濃度	余分なバンドを避けるために、濃度やインキュベーション時間を減らしてください。
	二次抗体の高濃度	非特異的結合を減らすために、濃度を下げ、二次コントロールのみを含めます。
	報告されていないタンパク質またはファミリーメンバーの検出	文献または BLAST をレビューし、推奨される細胞株/組織を使用します。
	報告されていないタンパク質またはファミリーメンバーの検出	検証されれば、新しいタンパク質を発見したことになるかもしれません!
笑顔のバンド	高速移行、高バッファ温度、過負荷、低バッファ	移動を遅くし、バッファーを事前に冷却し、タンパク質負荷を減らし、バッファーがウェルを完全に覆っていることを確認します。
しかめ面バンド	デバイスの問題（例：ジェルの下の気泡）	気泡を除去し、ゲルの重合が均一になるように設定を調整します。
テーリングバンド	サンプルの溶解性が低い、劣化している、バッファーを再利用している	サンプルをよく混ぜ、新鮮なサンプルを使用し、新鮮なランニングバッファーを準備します。
ダンベル型バンド	不均一なゲル重合、不純なサンプル	均一性を保つためにゲルを再鋳造し、使用前にサンプルを遠心分離します。
バンドの汚れ	過剰な負荷、ゲルの品質不良	サンプル量を減らし、ゲルの準備を改善します。
バブルマーク	転送中に閉じ込められた空気	転写サンドイッチを組み立てるときに気泡を取り除いてください。
不均一な黒い斑点	溶解していないブロッキング溶液、不均一な抗体分布	ブロッキング溶液を完全に溶解し、TBST で 3 回洗浄し、インキュベーション中に撹拌します。
白い斑点	高抗体濃度枯渇基質	一次/二次抗体の濃度を下げます。

Ⅳ.製品選択と最適化ツール

Yeasenは、ワークフローを効率化するための包括的な試薬スイートを提供します

関連製品:

手順	カタログ番号	製品名	仕様
サンプルの準備	20101ES	RIPA溶解バッファー（強）	100mL
	20115ES	RIPA 溶解バッファー (中)	100mL
	20114ES	RIPA溶解バッファー（弱）	100mL
	20118ES	WB/IPアッセイ用溶解バッファー	100mL
	20201ES	BCA タンパク質定量キット (強化版)	500T/2500T/5000T
	20200ES	BCA タンパク質定量キット（すぐに使用可能）	500トン
SDS-PAGE電気泳動	20350ES	ゴールドバンドプラス 3色レギュラーレンジタンパク質マーカー(8-180 kDa)	250μL/2×250μL/10×250μL
	20352ES	GoldBand™ 3色高範囲タンパク質マーカー (10-245 KDa)	2×250μL/10×250μL
	20328ES	SDS-PAGEゲル調製キット	1キット（30〜50ゲル）/ 1キット（150〜250ゲル）
	20324ES - 20327ES	PAGE ジェルクイック準備キット	濃度: 8%、10%、12.5%、15%
	36259ES-36280ES	プレキャストプロテインプラスジェル	濃度: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% ロードウェルオプション: 10 ウェル、12 ウェル、15 ウェル
膜転写とブロッキング	36125ES	0.45 μm PVDFメンブレン（1ロール、30cm×3m）	1ロール
膜転写とブロッキング	36126ES	0.22 μm PVDFメンブレン（1ロール、30cm×3m）	1ロール
抗体インキュベーション	36206ES	WB用一次抗体および二次抗体希釈液	100mL/500mL
タンパク質検出	36208ES	スーパーECL検出試薬	100mL/500mL
タンパク質検出	36222ES	強化ECL化学発光基質キット	100mL/500mL

V. サポートを受ける方法

個別のトラブルシューティングやプロトコルの最適化の場合:

訪問: Yeasen ウェスタンブロット製品ページ
メールアドレス: info@yeasenbio.com

成功の黄金律:標準化された手順 + 高品質の試薬 + 段階的な検証 = 再現可能な WB 結果!