1. 수지상 세포(DC)는 무엇입니까?
수지상 세포(DC)는 인체에서 가장 효과적인 항원 제시 세포(APC)입니다. DC는 순진한 T 세포 증식을 강력하게 자극할 수 있는 유일한 APC입니다. 다른 유형의 APC(예: 단핵구, 대식세포, B 세포 등)는 활성화된 T 세포 또는 기억 T 세포만 자극할 수 있습니다. 따라서 DC 세포는 적응성 T 세포 면역 반응의 개시자이며 종양 면역에서 매우 중요한 역할을 합니다. DC 세포는 표면에 MHC-I 및 MHC-II 분자를 고도로 발현하며 특정 표면 마커를 가지고 있습니다. 이들은 T 세포를 흡수, 처리 및 자극하여 항원을 활성화하고 궁극적으로 T 세포의 분화 방향을 결정합니다.
2. DC의 출처
DC 세포는 체내에 매우 소량으로 존재합니다. 체내에서 DC를 직접 분리하는 데 오랜 시간이 걸리고 세포 수율이 매우 낮아 DC의 연구 및 응용이 크게 제한됩니다. 그러나 DC는 골수액의 전구 세포, 말초 혈액 및 제대혈의 단핵구와 같이 다양한 조직의 DC 전구 세포에서 분화 및 유도될 수 있습니다.
인간의 경우, 인간의 말초혈은 얻기 가장 편리하고 단핵구의 수가 가장 많기 때문에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 인간 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 DC를 유도하는 것입니다. 마우스의 경우, 가장 일반적인 방법은 골수 세포, 즉 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서 DC를 유도하는 것입니다.
그림 1. 고전적 BMDC 제조 방법의 개략도
3. BMDC 제조 방법
마우스 BMDC를 준비하는 일반적인 방법은 다음과 같습니다.
3.1 고전적 BMDC 배양법 - Inaba법(개정)
3.2 BMDC의 대량 제조 - Sons 방법
3.3 BMDC의 대량 제조 - Lutz 방법
3.1 [고전 BMDC 배양법] - 이나바법(개량)
【 배경 】
에이. Inaba방법으로 얻은 BMDC의 수는 5-7 x 10 6 /마우스이다.
비. 원래의 이나바 방법은 BMDC의 생성을 유도하기 위해 GM-CSF만을 사용합니다. 획득된 BMDC는 혼합 림프구 반응에서 강력한 자극 능력을 가지고 있지만, DC의 성숙도는 GM-CSF+IL-4의 결합 유도만큼 좋지 않습니다. 따라서 이후의 개선된 방법은 종종 GM-CSF+IL-4의 결합 유도를 사용합니다.
【 재배 단계 】
3.1.1 마우스 골수 세포 획득
1) 생쥐(6-10주령)를 경추 탈구로 죽였고, 대퇴골과 경골을 모두 수술적으로 제거하고, 뼈 주변의 근육 조직을 가위와 집게로 가능한 한 많이 제거했습니다.
[ 주의사항 ] 뼈를 손상시키지 마십시오.
2) 뼈를 깨끗한 벤치로 옮기고 70% 알코올이 들어 있는 멸균 배양 접시에 2~5분간 담가 소독 및 살균한 다음, 멸균 PBS로 두 번 씻습니다.
3) 뼈를 PBS가 들어 있는 다른 새로운 배양 접시로 옮기고, 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자른 다음, 주사기를 사용하여 PBS를 추출합니다. 바늘을 뼈의 양쪽 끝에서 골수강에 삽입하고, 뼈가 완전히 하얗게 될 때까지 배양 접시에 골수를 반복해서 흘립니다.
4) 골수 현탁액을 수집한 후 200메시 나일론 메쉬로 작은 조각과 근육 조직을 걸러냅니다.
5) 여과액을 1200에서 원심분리합니다. 5분 동안 rpm으로 처리한 후 상층액을 버립니다.
6) 적혈구 용해 완충액(1x) 2ml의 염화암모늄을 첨가하고 세포를 현탁시킨 후 실온에서 3~ 5분간 , 최대 10분간 배양한다. 최소
7) 용해 완충액의 효과를 중화하기 위해 10ml PBS를 첨가한 후, 1200rpm에서 5분간 원심분리 하고 상층액을 버립니다.
8) PBS로 한 번 세척한 다음, 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배양 배지에 세포를 재부유시킵니다. 마우스 골수 세포를 얻었습니다.
염화암모늄 적혈구 용해 용액의 제조:
에이. 다음과 같이 10배 저장 용액을 준비하세요: 무게 82.9 g NH 4 Cl, 10.0g KHCO 3 및 0.37g Na 2 EDTA를 1L 증류수에 녹인 후 0.22로 여과합니다. μm 필터 멤브레인으로 살균하고 4℃에서 6개월 동안 보관합니다.
비. 사용 전, 10배 보관용액과 멸균 증류수를 1:9의 비율로 섞어 1배 사용용액으로 희석하세요.
[ 참고 ] 염화암모늄 적혈구 용해액은 골수세포에 어느 정도 해로운 영향을 미치므로 용혈시간을 최대한 단축해야 합니다.
3.1.2 BMDC 분화 유도
1) 1단계에서 얻은 마우스 골수 세포를 계수하고 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 완전 배양배지를 사용하여 세포 농도를 0.5~1× 10 6 /ml로 조정합니다.
2) 24-well 배양판에 well당 1ml의 세포를 넣고 재조합 마우스 GM-CSF(20 ng/mL )와 IL-4(10 ng/mL )를 첨가한 후 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양한다. 이는 배양 0일차이다.
【 메모 】
에이. 일반적으로 한 마리의 쥐로부터 약 4-5x10 7 개의 골수 세포를 수확할 수 있으므로, 24웰 플레이트의 최소 40-50웰을 도말할 수 있습니다.
비. GM-CSF와 IL-4의 농도 범위는 각각 20~50 ng/mL , 10~40 ng/mL 입니다 .
3) 2일에 한 번씩 배양판을 가볍게 흔든 후, 용량의 3/4을 새로운 배양배지로 교체하고 사이토카인을 보충합니다.
4) 5일차와 8일차 사이에 배양액을 살짝 불어서 부유 세포와 느슨하게 부착된 세포를 모으세요.
5) 1200에서 원심분리 5분 동안 rpm으로 처리한 후 상층액을 버립니다.
6) 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 완전배지에서 세포를 현탁시키고 세포를 계수한 후, 세포 농도를 1×10 6 /ml로 조정하고 재조합 마우스 GM-CSF(20 ng/mL )와 IL-4(10 ng/mL )를 첨가합니다.
7) 세포를 100mm 배양접시(접시 당 최대 10ml) 또는 6웰 배양 플레이트(웰당 2m)에 도말합니다.
8) 37℃, 5% CO 2 배양기에서 1~2일간 계속 배양합니다.
9) 더 성숙한 BMDC인 부유 세포를 수집합니다.
【 메모 】
에이. 2.5~2.8단계는 재도금 단계로, 2.4단계에서 얻은 BMDC를 더욱 성숙시키는 것이 목적입니다.
비. 재도말 후 3시간 이내에 많은 가시 모양의 부착 세포가 DC 클러스터에서 이동하는 것을 볼 수 있으며, 배양 1일 후에는 이러한 부착 세포가 배양 플레이트 바닥에서 분리된 것을 확인할 수 있으며, 많은 전형적인 DC가 배양 배지에 떠다니는 것을 볼 수 있습니다.
3.1.3 BMDC의 완전 성숙
[참고] 2단계에서 얻은 BMDC는 완전히 성숙한 DC가 아닙니다. 완전히 성숙한 DC를 얻으려면 여전히 LPS, CD40L 또는 TNF-a로 유도해야 합니다.
1) 2.4 또는 2.9단계에서 얻은 BMDC를 1200에서 원심분리합니다. 5분 동안 rpm으로 처리한 후 상층액을 버립니다.
2) 재조합 마우스 GM-CSF(20 ng/mL )와 IL-4(10 ng/mL ) 를 함유한 RPMI 완전 배양배지로 침전물을 현탁시키고 , 세포 농도를 계수 후 1×10 6 /ml로 조정합니다.
3) 24웰 배양판에 추가하고 TNF-α(250 U/mL ), LPS(1) 와 같은 성숙 유도제를 추가합니다. μg/mL), 또는 CD40L(1 μg/mL).
4) 37℃, 5% CO 2 배양기에서 2일간 배양합니다.
5) 부유 세포와 벽에 느슨하게 붙어 자라는 세포, 즉 성숙한 수지상 세포를 수집합니다.
3.2 【 BMDC 양산방식 】 - Son 방식
【 배경 】
에이. 이 방법은 7일 이내에 30-40×10 6 DC/마우스를 얻을 수 있으며, 이는 Inaba 고전적 방법의 7-10배입니다. DC를 14.5% 메트리자미드 구배를 통해 원심분리한 후, 순도(즉, CD11c+/I-Ab+ 세포)는 85-95%에 도달할 수 있습니다.
비. 이 방법으로 얻은 DC의 세포내포능력은 이나바 고전적 방법에 비해 약하지만, 분비되는 IL-12p70의 양은 비슷하다.
기음. 이 방법으로 얻은 DC는 이나바 고전적 방법보다 혼합 림프구 반응에서 더 강한 자극 능력을 가지고 있습니다.
디. 이 방법으로 얻은 DC는 더 강한 특정 T 세포 반응을 유도할 수 있습니다.
이자형. 요약하자면, Son 방법은 기존 방법보다 점점 더 성숙한 BMDC를 얻을 수 있습니다.
【 재배 단계 】
3.2.1 마우스 골수세포 획득
Inaba 방법(수정된)의 해당 단계를 참조하세요.
3.2.2 대량의 BMDC 제조
1) 1단계에서 얻은 마우스 골수 세포를 계수하고 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 완전 배양 배지를 사용하여 세포 농도를 2×10 5 /ml로 조정합니다 .
2) 6-웰 배양 플레이트에 웰당 5ml 세포를 펴 바르고 재조합 마우스 GM-CSF(1000 U/mL )와 IL-4(1000 U/mL )를 첨가한 후 37℃, 5% CO 2 배양기 에서 배양합니다 .
3) 배양 4일차에 재조합 마우스 GM-CSF(1000 U/mL )와 IL-4(1000 U/mL ) 를 배양계에 보충한다 .
4) 배양 7일째에 DC를 수집하여 2-4배지로 재부유시킨다. ml RPMI 1640 완전배지, 14.5%(w/v) 메파네마와 동일한 부피로 첨가하고 실온에서 20분간 원심분리합니다. 최소 1200xg .
5) 중간층을 모아서 나중에 사용하기 위해 RPMI 1640 완전 배양 배지로 세 번 씻어냅니다.
[메모] 이 시점에서 DC는 미성숙한 BMDC입니다. 더 성숙시키고 싶다면 3단계로 건너뛰세요.
3.2.3 BMDC의 완전 성숙
1) 2.4단계에서 수집한 BMDC를 재도금하고 재조합 마우스 GM-CSF(1000)를 첨가했습니다. U/mL ) 및 IL-4(1000 U/mL ) 및 LPS(1-10 μg/mL )을 배양계에 첨가
2) 성숙한 BMDC를 얻기 위해 37℃, 5% CO 2 배양기에서 2일간 배양하였습니다.
3.3 【 BMDC 대량 제조 방법 】 - Lutz 방법
【 배경 】
에이. 루츠법은 손법과 유사하며, 두 방법 모두 대량으로 BMDC를 제조할 수 있으나, 루츠법이 손법보다 더 널리 사용됩니다.
비. 이 방법을 사용하면 마우스당 1-3 x 10 8 DC 까지 더 많은 BMDC를 얻을 수 있으며 순도는 90-95%에 도달할 수 있습니다.
기음. 이 방법에서 사용하는 사이토카인 농도는 Son 방법보다 훨씬 낮아 200 U/mL 에 불과하며 배양 8~10일차에는 30~100 U/mL 로 떨어져 시약 비용을 대폭 절감할 수 있습니다.
디. 이 방법과 이나바 고전적 방법 및 손 방법의 가장 큰 차이점은 골수 세포를 세포 배양 플레이트가 아닌 박테리아 배양 접시(페트리 접시)에서 배양한다는 것입니다. 이나바는 박테리아 배양 접시는 골수 내 대식세포가 벽에 부착하기 쉽지 않아 대식세포의 발달을 억제하고 대식세포가 DC 성숙에 미치는 억제 효과를 피할 수 있다고 설명했습니다. 이것이 이 방법이 낮은 도금 밀도에서 많은 수의 BMDC를 얻을 수 있는 주된 이유일 수 있습니다.
이자형. 그러나 이 방법의 배양 시간은 비교적 길어 10~12일이 걸립니다. 한편으로는 더 많은 BMDC를 얻기 위한 것입니다. 다른 한편으로는 대부분의 과립구와 림프구는 그렇게 오랜 시간 동안 생존하기 어렵기 때문에 최종적으로 얻은 BMDC의 순도를 향상시킬 수 있습니다.
에프. 이 방법은 유도 배양에 GM-CSF만 사용하고, 얻은 BMDC에는 미성숙 DC와 성숙 DC가 모두 들어 있습니다. 성숙도를 더욱 개선하려면 유도 1~2일 동안 LPS 또는 TNF-α를 사용해야 하며, 성숙 DC 세포의 함량은 50~70%에 도달합니다.
【 재배 단계 】
3.3.1 마우스 골수세포 획득
Inaba 방법(수정된)의 해당 단계를 참조하고, 용혈 단계는 생략해야 한다는 점에 유의하세요.
3.3.2 BMDC의 대량 제조
1) 1단계에서 얻은 마우스 골수 세포를 계수하고 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 완전 배양 배지를 사용하여 세포 농도를 2×10 5 /ml로 조정합니다.
2) 100mm 세균배양접시(페트리디쉬)에 10ml의 세포를 넣고 재조합 마우스 GM-CSF(200 U/mL )를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다.
[주의] 여기서는 세포배양판이 아닌 세균배양접시를 사용합니다.
3) 3일차에 20 ng/mL 재조합 마우스 GM-CSF가 함유된 완전 배양 배지 10ml을 배양 접시에 첨가합니다.
4) 6일차와 8일차에 배지의 절반을 교체합니다. 즉, 기존 배양 배지를 수거하고 원심분리 후 20ng/mL 재조합 마우스 GM-CSF가 포함된 완전 배양 배지로 세포 펠릿을 재부유시킨 후, 세포 현탁액을 원래 접시에 다시 넣습니다.
5) 10일째 되는 날, BMDC인 세포를 채취할 수 있습니다.
3.3.3 BMDC의 완전한 성숙
1) 배양 10일차에 피펫으로 DC를 살짝 불어서 부유 세포를 모으고, 실온에서 5분간 300xg로 원심분리합니다.
2) 상층액을 버리고, 세포 펠릿을 10ml RPMI 1640 완전 배양 배지로 재부유시킨 후, 100mm 세포 배양 판에 도말합니다.
3) 재조합 마우스 GM-CSF(100 U/mL ) 및 TNF-α(500 U/mL ) 또는 재조합 마우스 GM-CSF(100 U/mL ) 및 LPS(1 (μg/mL))
4) 37℃, 5% CO 2 배양기에서 1~2일간 계속 배양합니다.
4. BMDC 식별
엘 형태학적 관찰: 대부분의 BMDC는 군집으로 성장하며 세포에는 여러 개의 수지상 돌기가 있는데, 이는 성숙한 BMDC에서 더 뚜렷하게 나타납니다.
엘 세포 표현형 분석: 유세포 분석법을 사용하여 DC 세포 표면에서 CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC 클래스 II 분자(IA/IE)의 발현을 감지했습니다. BMDC는 이러한 분자를 매우 많이 발현하며, 완전히 성숙한 BMDC에서 이러한 분자의 발현은 더욱 증가할 것입니다.
엘 혼합 림프구 반응(MLR): BMDC는 강한 자극 능력을 가지고 있으며, 성숙도가 높을수록 자극 능력이 강해집니다.
5. 성숙 유도제는 어떻게 선택하나요?
LPS, CD40L 및 TNF-α는 일반적으로 사용되고 효과적인 성숙 유도제이며, 인간 DC와 마우스 DC 모두에 사용됩니다. TNF-a는 세 가지 중에서 DC 성숙을 유도하는 능력이 가장 약합니다. LPS와 CD40L은 모두 시험관 내에서 DC 완전 성숙을 위한 강력한 유도제입니다. 두 가지 모두에 의해 유도된 DC의 성숙은 유사하지만 유도된 사이토카인 스펙트럼은 다릅니다. CD40L로 유도된 성숙 BMDC는 보호 및 치료적 종양 면역 반응의 생성을 포함하여 생체 내에서 가장 강력한 면역 조절 능력을 보여줍니다. LPS로 DC 완전 성숙을 자극하는 데 사용되는 농도는 일반적으로 1-10 μg/mL이지만 실제로 0.1 μg/mL이면 효과가 매우 강하지만 보험 목적으로는 1 μg/mL이 일반적으로 사용됩니다. CD40L 분자는 TNF 리간드 패밀리에 속하며, 이는 삼중체를 형성한 후에만 기능할 수 있다는 특징이 있습니다. 따라서 재조합 CD40L 삼중체 단백질을 사용하여 DC를 자극하는 것이 가장 좋으며, 이는 좋은 효과를 낼 것입니다. CD40L 단량체를 사용하여 DC를 자극하는 경우 대부분의 경우 성숙도가 그리 높지 않습니다.
6. 훈련 방법 선택
표 1. BMDC 제조를 위한 세 가지 일반적인 실험 방법의 비교
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매개변수 |
클래식 BMDC 배양법 - 이나바법 |
BMDC의 대량 제조 - Son 방법 |
BMDC의 대량 제조 - Lutz 방법 |
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PubMed의 인용 횟수 |
783 |
24 |
663 |
|
골수용혈, 적혈구 용해 |
예 |
예 |
아니요 |
|
골수는 먼저 림프구를 제거합니다. |
예 |
아니요 |
아니요 |
|
배양 중 과립구 제거 |
예 |
아니요 |
아니요 |
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골수세포의 초기 도금량 |
1ml |
15ml |
10ml |
|
부란기 |
24웰 세포 배양 플레이트 |
6-웰 세포 배양 플레이트 |
100mm 세균 배양 접시 |
|
배양 매체 |
RPMI 1640+10% FCS |
||
|
마우스 GM-CSF 농도 |
200~1000 유로/mL |
초기 첨가 농도는 125-1000 U/mL 입니다. 4일차와 7일차에 충분한 양의 GM-CSF와 IL-4를 배양계에 첨가합니다. |
초기 첨가 농도는 200 U/mL 입니다. 10일차 이후에는 3-100 U/mL 입니다. |
|
마우스 IL-4 |
필요하지 않습니다 |
필요량 ， 농도는 GM-CSF와 동일 |
필요하지 않습니다 |
|
유체 교환 방법 |
2일차와 4일차에는 기존 배양배지(세포가 들어 있는 배지)의 50~75%를 폐기하고 충분한 GM-CSF가 들어 있는 새로운 완전 배양배지로 교체합니다. |
/ |
3일째에 GM-CSF가 포함된 완전 배양 배지를 같은 양만큼 첨가했습니다. 6일, 8일, 10일째에 배지의 절반을 교체했습니다. 오래된 배양 배지(세포 포함)를 흡인하고 원심분리한 후 GM-CSF가 포함된 새로운 완전 배양 배지에 현탁한 다음 다시 넣었습니다. |
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통과 전 배양 시간(확장) |
6일 |
7일 |
10일 |
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통과(성숙) 후 배양 시간 |
2일 |
없음 |
1-2일 |
|
완전 성숙 유도제 |
TNF-ɑ ( 250 U/mL ) |
LPS(1-10 (μg/mL) |
TNF-ɑ ( 250 U/mL ) 또는 LPS(1 (μg/mL) |
|
DC 세포 수확 시간 |
7-8일 |
7-8일 |
10~13일 |
|
DC 순수성 |
8일차 ： 60-70% |
7일차 ： 85-95% |
10-12일차 ： 80-90% |
|
DC 생산/마우스 |
(5-7)×10 6 |
(3-4)× 107 |
(1-3)×10 8 |
7. 추천 DC 배양 시약
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제품 이름 |
고양이 |
크기 |
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91108 에스 |
5 μg/50 μg/100 μg/500 μg |
|
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90144ES |
5 μg/50 μg/100 μg/500 μg |
|
|
90621ES |
5 μg/20 μg/50 μg/500 μg |
|
|
94016ES |
25 μg/100 μg/500 μg |