1. 라미닌 521의 배경
라미닌 521(LN521)은 자연 줄기 세포 틈새의 핵심 세포 접착 단백질이며 인간 배아(hES) 및 유도 다능성 줄기 세포(hiPSC)의 배양 및 확장을 위한 매트릭스입니다. LN521은 세포 표면 수용체에 결합하여 세포 신호 전달 경로를 활성화하여 더 많은 기능적 세포를 생성합니다.
라미닌 521은 시험관 내에서 생물학적으로 관련성 있는 hPSC 환경을 재현하고, hPSC의 부착, 높은 생존율 및 강력한 장기 자가 재생을 촉진하며, 줄기 세포 성장을 지원하고 기저막 구조와 성능의 안정성을 유지하는 핵심 매트릭스 단백질입니다. 라미닌 521은 또한 가장 일반적으로 사용되는 무영양 배양 매트릭스 중 하나입니다. 또한 라미닌 521은 어떠한 세포 사멸 억제제도 첨가하지 않고도 유전적으로 안정적이고 다능성 줄기 세포의 효율적인 단일 세포 통과를 달성할 수 있습니다. 세포는 분화 영역을 수동으로 제거할 필요 없이 균일한 단층에서 자랍니다. 또한 연구에 따르면 LN521은 핵형 이상 징후 없이 10세대 이상 PSC 성장을 지원할 수 있으며 PSC가 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세 배엽으로 분화하는 능력을 유지합니다.
그림 1. 라미닌 521 구조 [1]
2.라미닌 코팅 실험
2.1 멸균 탈이온수 또는 주사용수로 라미닌 521을 400µg/ml로 준비합니다. 사용 전에 멸균 1×DPBS(Ca++/Mg++)로 100µg/ml로 더 희석한 다음 멸균 DPBS(Ca++/Mg++)로 5-10µg/ml의 작업 농도로 희석하는 것이 좋습니다. 코팅 농도는 배양된 세포의 유형에 따라 다르며 세포에 대한 최적의 코팅 농도를 결정하기 위해 실험 프로토콜을 최적화하는 것이 좋습니다. 권장 농도는 표 1을 참조하십시오.
참고: 단백질 구조와 기능에는 2가 양이온이 중요하므로 Ca 2+ 및 Mg 2+ 를 함유한 DPBS를 사용해야 합니다. Laminin 521의 필요한 작업 농도는 세포와 응용 분야에 따라 달라집니다. 초기 코팅 농도는 0.5μg/cm 2 를 권장합니다.
표 1. 다양한 배양 용기에 권장되는 재조합 인간 라미닌 작업 용액의 양.
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페트리 접시 |
코팅 농도（μg/mL） |
LN521의 첨가량 |
1*DPBS 첨가량 |
총 볼륨 |
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6 웰 |
5 |
50 μL/웰 |
950 μL/웰 |
1mL/웰 |
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12 웰 |
5 |
25 μL/웰 |
475 μL/웰 |
0.5ml/웰 |
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24 웰 |
5 |
15 μL/웰 |
285 μL/웰 |
0.3mL/웰 |
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48 웰 |
5 |
7.5 μL/웰 |
142.5 μL/웰 |
150 μL/웰 |
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96 웰 |
5 |
3.5 μL/웰 |
66.5 μL/웰 |
70 μL/웰 |
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35mm 페트리 접시 |
5 |
50 μL/웰 |
950 μL/웰 |
1mL/웰 |
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60mm 페트리 접시 |
5 |
100 μL/웰 |
1900 μL/웰 |
2mL/웰 |
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100mm 페트리 접시 |
5 |
300 μL/웰 |
5700 μL/웰 |
6mL/웰 |
위의 용량은 5μg/mL의 코팅 농도를 기준으로 합니다.
2.2 지정된 양의 라미닌-DPBS 혼합물을 각 웰에 넣고 가볍게 흔듭니다. 코팅되지 않은 표면은 세포 성장을 지원하지 않으므로 전체 표면이 라미닌 코팅 용액으로 덮여 있는지 확인합니다.
2.3. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 밤새도록 인큐베이션합니다. 최소 인큐베이션 시간은 2시간이지만, 이상적인 세포 배양 조건을 얻으려면 밤새도록 인큐베이션하는 것이 좋습니다. 배양 용기가 마르지 않도록 주의하세요. 마르면 LN521이 불활성화됩니다.
2.4. 세포가 접종될 준비가 되면 라미닌 521 용액을 흡입합니다.
3.iPSC 문화
3.1 iPSC 해동(12-well plate를 예로 들어 설명)
3.1.1 iPSC를 액체질소나 건조얼음에서 꺼내 37°C의 물에 10초간 담가 해동합니다.
3.1.2 75% 알코올로 크라이오바이알을 살균한 후 작업 표면으로 옮깁니다.
3.1.3 세포를 9 mL DMEM‑F12가 들어있는 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
3.1.4 15 mL 원심분리관을 실온에서 5분 동안 300g로 원심분리합니다.
3.1.5 코팅된 12웰 플레이트에서 라미닌 용액을 폐기합니다.
3.1.6 세포 상층액을 버리고 iPSC를 1 mL mTeSR-plus(10 µM Y-27632 포함)에 부드럽게 현탁하여 코팅된 12웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 흔들어 세포를 1×10^5 cells/well의 최종 세포 밀도로 고르게 분포시키고 실온에서 10분간 방치합니다. 배양액이 4-5일 이내에 통과되도록 합니다.
3.1.7 12웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣어 배양합니다.
3.1.8 ROCK 억제제가 포함된 배양배지는 12~16시간 후에 제거하고, 억제제가 없는 배지에서 계속 배양해야 합니다.
표 2. 다양한 배양 용기에서의 세포 접종 밀도, 세포 수는 세포 성장 속도에 따라 결정됨
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세포 배양 용기 |
6 웰 |
12 웰 |
24 웰 |
96 웰 |
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휴대폰 번호 |
2.5~3.5× 105 |
6~8× 104 |
3~4× 104 |
0.5~1× 104 |
3.2. iPSC 패시징 프로토콜
3.2.1 배양 상층액을 버리고 1 mL PBS(Ca ‑‑ /Mg ‑‑ )로 씻어냅니다.
참고사항: 2가 양이온은 일부 해리 효소에 부정적인 영향을 미치므로 Ca2+와 Mg2+가 없는 PBS를 사용하세요.
3.2.2 PBS를 버리고 0.5mL의 Gentle Cell Dissociation Reagent를 첨가합니다. 실온에서 6-8분 동안 배양하거나 세포가 더 이상 플레이트에 결합되지 않을 때까지 현미경으로 관찰합니다.
3.2.3 DMEM-F12를 같은 양만큼 첨가하고, 세포를 가볍게 섞은 후, 실온에서 원심분리관에 옮기고, 300g에서 5분간 원심분리합니다.
3.2.4 세포를 계대배양하기 전에 라미닌으로 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다.
3.2.5 상층액을 버리고 10 µM Y‑27632가 포함된 mTeSR‑plus 배지에 세포를 재부유시킵니다.
3.2.6 세포를 준비된 라미닌 코팅 12웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 세포를 고르게 분산시키고 실온에서 10~20분 동안 방치합니다.
3.2.7 12웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 배양합니다.
참고: iPSC는 단층으로 성장한 후 빠르게 분화되고 죽습니다. 성장과 다능성을 유지하려면 합류하기 전에 통과해야 합니다.
3.3. iPSC의 냉동보존
3.3.1 온화한 세포 분리 시약을 준비하세요.
3.3.2 iPSC 배양 프로토콜에 따라 세포를 분리하고, 냉동보관 전 세포 밀도를 확인하기 위해 세포소기관 수를 계산합니다.
3.3.3 각 세포 튜브는 1-2×10^6의 세포 밀도로 동결해야 합니다. iPSC 패시징 프로토콜에서 원심분리 및 세포 배양 배지 제거 단계를 따릅니다. 분리된 iPSC 펠릿을 적절한 양의 냉동보존 용액에 재현탁합니다.
3.3.4 현탁된 세포 동결보존 펠렛 1 mL를 1.5 mL 동결보존 튜브에 넣고 프로그램 냉각을 실시한 후, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
4. 라미닌 코팅에 대한 중요 참고 사항
4.1. 실험 프로토콜의 모든 단계는 무균 조건에서 수행되어야 합니다.
4.2. 라미닌을 장시간 실온에 노출시키지 마십시오.
4.3. 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.
4.4. 해동 후 원액 단백질 스톡 용액은 무균 조건 하에 2~8℃에서 보관할 수 있으며 최소 3개월 동안 안정적으로 보관할 수 있습니다.
5.관련 상품 정보
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제품 이름 |
고양이# |
크기 |
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92602ES |
10μg/100μg/500μg/1mg |
6. 참고문헌
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. 라미닌 β2 짧은 팔의 결정학적 분석은 LF 도메인이 LE 도메인의 규칙적인 배열에 어떻게 삽입되는지 보여줍니다. Matrix Biol. 2017년 1월;57-58:204-212.