Ct 값은 형광 정량 PCR에서 중요한 결과 표현입니다. 유전자 발현 수준이나 유전자 복사 수의 차이를 계산하는 데 사용됩니다. 그렇다면 형광 정량에서 어떤 범위의 Ct 값이 합리적이라고 간주될 수 있을까요? Ct 값이 효과적인 범위 내에 있는지 어떻게 확인할 수 있을까요? 오늘은 Xiao Yi가 모든 사람을 대신하여 이 질문에 답하도록 하겠습니다.
Ct 값은 무엇입니까?
qPCR 증폭 과정에서 Ct 값은 증폭된 생성물의 형광 신호가 설정된 형광 임계값에 도달하는 증폭 사이클 수(Cycle Threshold)를 나타냅니다. "C"는 Cycle을 의미하고 "T"는 Threshold를 의미합니다. 간단히 말해서, Ct 값은 qPCR에서 시작 템플릿이 특정 양의 생성물에 도달하는 데 걸리는 사이클 수이며, 나중에 자세히 설명합니다.
Ct 값의 기능은 무엇입니까?
1. 지수 증폭, 템플릿 수량 및 Ct 값 간의 관계
이상적인 시나리오에서 qPCR 동안 유전자는 기하급수적으로 증폭되고 특정 횟수의 사이클에 걸쳐 축적됩니다. 증폭 사이클 수와 생성물의 양 간의 관계는 다음과 같이 표현할 수 있습니다. 증폭된 생성물의 양 = 초기 템플릿 양×(1 + En)^사이클 수. 그러나 qPCR 반응은 항상 이상적인 조건에서 발생하는 것은 아닙니다. 증폭된 생성물의 양이 "특정 생성물 양"에 도달하면 이 지점의 사이클 수는 Ct 값이며, 이는 기하급수적 증폭 기간을 나타냅니다. Ct 값과 초기 템플릿 양 간의 관계는 다음과 같습니다. 템플릿의 Ct 값과 해당 템플릿의 초기 사본 수의 로그 사이에는 선형 관계가 있습니다. 초기 템플릿의 농도가 높을수록 Ct 값이 낮아지고, 초기 템플릿의 농도가 낮을수록 Ct 값이 높아집니다.
2. 증폭곡선, 형광 임계값 및 특정 제품 수량
qPCR 증폭 산물의 양은 형광 신호의 형태로 직접 표현되며, 이를 증폭 곡선이라고 합니다. PCR의 초기 단계에서 증폭이 이상적인 조건에 있고 사이클 수가 적을 때, 산물의 축적은 최소이며 생성된 형광 수준은 배경 형광 노이즈와 크게 구별되지 않습니다. 그 후, 형광 생성은 지수 단계에 들어갑니다. PCR 산물의 양은 반응이 지수 단계에 막 진입할 때 특정 지점에서 감지할 수 있으며, 이를 "특정 산물의 양"이라고 합니다. 이를 사용하여 템플릿의 초기 함량을 추론할 수 있습니다. 따라서 특정 산물의 양에 해당하는 형광 신호 강도를 형광 임계값이라고 합니다.
PCR의 후반 단계에서는 증폭 곡선이 더 이상 지수적 증폭을 보이지 않고 선형 단계와 평탄 단계로 들어갑니다.
3. Ct 값의 재현성
PCR 사이클이 Ct 값이 발생하는 사이클 수에 도달하면, 그것은 진정한 지수 증폭 단계에 진입하는 것입니다. 이 시점에서 사소한 오류는 증폭되지 않았으므로 Ct 값의 재현성은 우수합니다. 즉, 동일한 템플릿이 다른 시간에 증폭되거나 동시에 다른 튜브에서 증폭되더라도 얻은 Ct 값은 일정하게 유지됩니다. 
Ct 값의 범위는 무엇입니까?
1. 증폭 효율 En
PCR 증폭 효율은 중합효소가 표적 유전자를 증폭 산물로 변환하는 효율을 말합니다. 증폭 효율은 한 DNA 분자가 두 DNA 분자로 변환될 때 100%입니다. 증폭 효율은 일반적으로 En으로 표시됩니다. 이후 기사에서 분석의 편의를 위해 증폭 효율에 영향을 미치는 요소에 대한 간략한 소개가 있습니다.
| 영향 요인 | 설명 | 판단 |
| A. PCR 억제제 | 1. 템플릿 RNA에는 단백질이나 세제 등 PCR 반응을 억제하는 물질이 포함되어 있을 수 있습니다. 2. 역전사 후 얻은 cDNA에는 템플릿 RNA와 역전사 시약 성분이 고농도로 포함되어 있을 수 있으며, 이는 이후의 PCR을 저해할 수도 있습니다. |
1. 오염 여부는 A260/A280 및 A260/A230 비율을 측정하거나 RNA 전기영동을 수행하여 평가할 수 있습니다. 2. 역전사 후 cDNA를 일정 비율로 희석하였는가. |
| 나. 비합리적인 프라이머 디자인 | 프라이머는 효과적으로 어닐링할 수 없습니다. | 프라이머에 다이머나 헤어핀 구조가 있는지 확인하고, 불일치가 있는 경우, 때로는 인트론에 걸친 디자인에 주의를 기울여야 합니다. |
| C.부적합한 반응 절차 | 1. 프라이머가 효과적으로 어닐링될 수 없습니다. 2. DNA 중합효소의 활동이 완전히 방출되지 않습니다. 3. 장시간 고온으로 인해 DNA 중합효소의 활동이 감소합니다. |
1. 어닐링 온도는 프라이머의 Tm 값보다 높습니다. 2. 사전 변성 시간이 너무 짧습니다. 3. 반응 프로토콜의 각 단계의 지속 시간이 너무 깁니다. |
| D. 시약이 완전히 혼합되지 않았거나 피펫팅 오류가 발생했습니다. | 반응 시스템에서 PCR 반응 성분의 국소 농도가 너무 높거나 고르지 않아 PCR이 지수적으로 증폭되지 않습니다. | / |
| E.앰플리콘 길이 | 앰플리콘 길이가 너무 길어서 300개 염기쌍을 초과하여 증폭 효율이 낮아집니다. | 앰플리콘 길이가 80개 염기쌍에서 300개 염기쌍 사이인지 확인하세요. |
| F. qPCR 시약의 영향 | 시약에 DNA 중합효소 농도가 낮거나 완충액에 이온 농도가 최적이 아니면 Taq 효소가 최대 활성에 도달하지 못합니다. | 표준 곡선은 프라이머의 증폭 효율을 측정하는 데 사용됩니다. |
2. Ct 값의 범위
Ct 값의 범위는 15-35입니다. 15 미만의 Ct 값은 기준선 단계 내에 있으며 형광 임계값에 도달하지 않은 것으로 간주됩니다. 이상적으로는 Ct 값과 템플릿의 초기 사본 수의 로그 사이에 선형 관계가 있으며 이를 표준 곡선이라고 합니다. 표준 곡선을 사용하여 증폭 효율이 100%일 때 유전자의 단일 사본을 정량화하기 위한 Ct 값은 약 35로 계산됩니다. Ct 값이 35보다 크면 이론적으로 템플릿의 초기 사본 수는 1보다 작아 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주할 수 있습니다. 
다양한 유전자의 경우, 유전자 사본의 초기 템플릿 양과 증폭 효율의 차이로 인한 Ct 값 범위가 있으므로 유전자의 선형 검출 범위를 계산하기 위해 해당 유전자에 대한 표준 곡선을 작성해야 합니다.
3. Ct 값에 영향을 미치는 요인
증폭 사이클 수와 생성물 양 사이의 관계에서 알 수 있듯이: 증폭 생성물 양 = 초기 템플릿 양 × (1 + En)^사이클 수, 이상적인 조건에서 초기 템플릿 양과 En은 Ct 값에 영향을 미칠 것임을 알 수 있습니다. 템플릿 품질이나 증폭 효율의 차이로 인해 Ct 값이 너무 높거나 너무 낮을 수 있습니다.
4. Ct 값이 너무 높거나 너무 낮음
샤오 이는 당사 기술 부서의 전문가와 협의하여 Ct 값과 관련된 두 가지 일반적인 문제의 원인과 해결책을 요약하여 독자들에게 정보를 제공했습니다.
| 문제 | 원인 | 솔루션 |
| Ct 값이 너무 높습니다 | 템플릿 농도가 낮거나 PCR 억제제가 존재합니다. 증폭 효율이 낮습니다. |
1. 템플릿 농도를 높이거나 RNA 또는 cDNA의 희석 비율을 높이거나 템플릿을 다시 준비합니다. 2. 어닐링 온도를 낮추거나 2단계 증폭 방법을 사용합니다. 구성 요소와 시스템이 완전히 혼합되었는지 확인합니다. 반응 프로토콜을 최적화하거나 시약을 교체해 보세요. |
| Ct 값이 너무 낮습니다 | 1. 높은 템플릿 농도 2. NTC(템플릿 제어 없음) 및 NRC(역제어 없음)의 오염 3. 부적절한 프라이머 디자인 |
1. 템플릿 RNA의 양을 줄이거나 cDNA를 더 높은 비율로 희석합니다. 2. 모든 시약을 새로 교체하거나 UDGase 오염 방지 시약을 사용하세요. 3. 비특이적 증폭을 피하기 위해 절차를 최적화하세요. |
이것으로 이 문제의 비정상적인 Ct 값 원인에 대한 분석이 끝났습니다. 다음으로, Xiao Yi는 실험 데이터가 더 정확하고 신뢰할 수 있도록 다양한 비용 효율적인 제품을 추천할 것입니다. 와서 가장 좋아하는 제품을 선택하세요!
| 제품 이름 | 고양이# | 크기 |
| Hieff UNICON™ 유니버셜 블루 qPCR SYBR 그린 마스터 믹스 | 11184ES08 | 5×1ml |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA 합성 SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100톤 |
| Hifair™ AdvanceFast 원스텝 RT-gDNA 소화 SuperMix for qPCR | 11151ES60 | 100톤 |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA 합성 키트(염료 없음) | 11150ES60 | 100톤 |