형광 정량 PCR(qPCR)은 실험실에서 일반적으로 사용되는 기술로, 유전자 발현 분석, 유전자형 분석, 병원체 검출, SNP 분석 등에 적용할 수 있습니다. qPCR의 작동은 간단하고 원리는 이해하기 쉽습니다. 이제 지저분한 데이터 더미에 직면하여 결과를 분석하는 방법은 어려운 과제가 되었습니다. 오늘, Xiao Yi가 복잡한 프로세스를 단순화하고 SCI 저널에 게재할 수 있는 데이터를 쉽게 얻는 방법을 안내해 드리겠습니다!
qPCR에서 사용되는 일반적인 분석 방법에는 상대 정량화와 절대 정량화가 있으며, 이러한 방법 간의 선택은 다양한 실험 설계에 따라 달라야 합니다. 이 호에서는 qPCR의 일반적인 응용 분야인 유전자 발현 분석에 초점을 맞출 것입니다. 여기서는 일반적으로 상대 정량화 방법이 선택됩니다.
실험 설계
현재 아라비돕시스 AtSUC2 유전자의 발현에 대한 광 유도의 효과를 연구해야 한다고 가정해 보겠습니다. 대조군은 어떠한 처리도 하지 않은 아라비돕시스 식물로 구성되고, 실험군은 특정 광 유도를 처리한 식물이 됩니다. 두 그룹에서 RNA를 추출하여 역전사하여 cDNA를 얻은 다음, 이를 템플릿으로 사용합니다. 아라비돕시스 GAPDH 유전자는 qPCR 실험의 내부 참조로 선택됩니다.
설정해야 할 qPCR 웰은 다음과 같습니다.
1) NTC (No Template Control)를 사용하여 PCR 시스템에 오염이 있는지 확인합니다.
2) NRT (No Reverse Transcription)는 역전사 과정을 거치지 않은 RNA를 주형으로 사용하는 방식으로, gDNA 오염을 통제하는 방식입니다.
3) 내부 참조 유전자는 샘플의 초기 농도 차이로 인해 발생하는 차이를 보정하는 데 사용됩니다.
4) 대조 샘플 의 선택은 일반적으로 다음 범주에 속합니다.
- 특정 처리가 유전자 발현에 미치는 효과를 평가하기 위해, 처리하지 않은 샘플을 참조 샘플로 사용합니다.
- 다른 시점에서의 유전자 발현의 차이를 검출하기 위해, 시간 0의 샘플을 참조 샘플로 사용합니다.
- 다양한 조직 간의 유전자 발현 차이를 비교하기 위해, 하나의 조직을 임의로 참조 샘플로 선택합니다.
여기서 주의할 점은 위에서 언급한 각 물질에 대해 3개의 PCR 웰(1, 2, 3)이 설정되었다는 것입니다. 이는 PCR 복제본으로, 기술적 복제본이라고도 하며, 운영상의 오류를 제거하고 증폭 효율을 정확하게 평가하기 위한 것입니다. 또한 생물학적 복제본을 설정해야 하는데, 이는 서로 다른 물질(다른 시간, 식물, 배치, 반응 플레이트)에 대해 동일한 실험을 수행하여 생물학적 가변성을 보정하고 처리에 통계적 유의성이 있는지 분석하는 것을 포함합니다. 특히 이 경우 실험군과 대조군 모두 적어도 두 세트 이상의 아라비돕시스 샘플(A, B, C)을 처리해야 합니다. 각 세트에서 RNA를 추출하여 역전사한 다음 qPCR을 수행합니다. 통계적 분석을 위해 세 가지 생물학적 복제본의 평균을 사용합니다.
결과 분석 - ΔΔCt 방법
ΔΔCt법의 특징은 계산을 위해 Ct 값에만 의존한다는 점이지만, 전제는 타겟 유전자와 참조 유전자의 증폭 효율이 비교적 일정해야 하며, 둘 다 90~110% 범위 내에 있어야 한다는 것입니다.
구체적인 계산 공식은 다음과 같습니다.
ΔCt = Ct(타겟 유전자) - Ct(참조 유전자)
ΔΔCt = ΔCt (실험군) - ΔCt (대조군)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
위의 실험을 아라비도프시스 AtSUC2 유전자의 발현에 대한 광 유도의 영향을 연구하는 것으로 가정하면, qPCR의 결과는 다음과 같습니다.
계산하는 동안, 우리는 먼저 대조군의 2^-△Ct 데이터의 평균을 계산합니다(위 그림에서 보듯이 0.00116). 그런 다음, 우리는 각 2^-△Ct 값을 이 평균으로 나누어 2^-△△Ct 값을 얻습니다. 마지막으로, 우리는 이 값들을 정리하여 평균과 표준 편차를 얻습니다. 이는 실험군의 표적 유전자 발현 수준이 대조군에 비해 약 9.73배 증가했음을 나타냅니다.
결과는 Graphpad 소프트웨어를 사용하여 다음과 같이 표시됩니다. 
소프트웨어의 t-검정을 사용하여 계산된 P값은 0.0024로, 0.05보다 작아 통계적으로 유의미한 차이가 있고 결과가 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.
결과 분석 - 이중 표준 곡선 방법
실제 응용에서 타겟 유전자와 참조 유전자의 증폭 효율이 종종 다르기 때문에 동일한 증폭 효율을 달성하기 위해 프라이머를 재설계하고 반응 조건을 최적화해야 합니다. 그러나 우리는 또한 더 편리한 방법인 이중 표준 곡선 접근 방식을 선택할 수 있습니다.
여기서는 먼저 절대 정량 분석 방법을 알아보겠습니다. 구체적인 단계는 PCR을 통해 타겟 단편을 증폭한 다음 타겟 단편을 클로닝 벡터에 삽입하고 재조합 플라스미드를 추출한 다음 시퀀싱을 통해 올바른지 확인한 후 표준으로 사용할 수 있습니다. 플라스미드 DNA의 양은 Nanodrop과 같은 기기를 사용하여 측정할 수 있으며, 복사 수는 복사 수 변환 공식을 사용하여 특정 플라스미드 사본으로 변환됩니다. 그런 다음 일련의 희석 후 DNA를 증폭합니다. 표준 곡선은 표준 복사 수의 로그를 x축으로, 측정된 Ct 값을 y축으로 하여 플롯합니다. 알려지지 않은 샘플의 Ct 값을 기준으로 절대 복사 수를 계산할 수 있습니다.
복사수 계산 공식:
복사수 = (질량 ÷ 상대 분자량) × 6.02 × 10^23
이중 표준 곡선 방법은 표적 유전자와 참조 유전자에 대한 표준 샘플을 별도로 구성하고, 절대 정량화를 수행하고, 표준 곡선을 만드는 것을 포함합니다. 알려지지 않은 샘플의 절대 사본 수를 계산한 후 비교를 수행하여 더 높은 정확도를 제공합니다.
구체적인 계산 공식은 다음과 같습니다.
Q = 타겟 유전자 사본 수 / 참조 유전자 사본 수
RQ = Q(실험) / Q(대조)
위에서 언급한 실험에서, 아라비도프시스 AtSUC2 유전자의 발현에 대한 광 유도의 영향을 조사하기 위해, AtSUC2와 GAPDH에 대한 표준 시료를 구성하고, 다음과 같은 표준 곡선을 작성했습니다.
검사 대상 샘플의 표적 유전자와 내부 참조 유전자에 대한 Ct 값은 다음과 같습니다.
계산 시, 먼저 표적 유전자와 내부 참조 유전자의 Ct 값을 표준 곡선의 선형 관계에 대입하여 실험군과 대조군 모두에서 표적 유전자와 내부 참조 유전자의 절대 사본 수를 구합니다. 그런 다음, Q = 표적 유전자 사본 수 / 참조 유전자 사본 수 공식을 사용하여 표적 유전자의 발현 수준을 정규화합니다. 마지막으로, RQ = Q(실험) / Q(대조군) 공식에 따라 RQ는 9.71로 계산되어 실험군의 표적 유전자 발현 수준이 대조군보다 9.71배 높음을 나타냅니다.
결과는 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 다음과 같이 표시됩니다.
소프트웨어의 t-검정을 사용하여 계산된 P 값은 0.0008이며, 이는 0.05보다 작아 통계적으로 유의미한 차이가 있고 결과가 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.
이것으로 이 세션의 qPCR 데이터 분석을 마칩니다. 다음으로, 실험 데이터가 더 정확하고 신뢰할 수 있도록 비용 효율적인 제품을 추천해 드리겠습니다. 와서 가져가세요!
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| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA 합성 SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100톤 |
| Hifair™ AdvanceFast 원스텝 RT-gDNA 소화 SuperMix for qPCR | 11151ES60 | 100톤 |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA 합성 키트(염료 없음) | 11150ES60 | 100톤 |