성숙한 miRNA의 길이는 약 20nt에 불과하며, 일반적으로 전방 프라이머는 전체 길이를 덮거나 심지어 과도한 부분이 있고, 역방향 프라이머는 어디에도 놓일 곳이 없습니다. 현재 시장 솔루션은 역전사 중에 역전사 길이를 늘리는 것입니다. 일반적인 방법으로는 테일링 방법과 스템-루프 방법이 있습니다.

1. 서론
2. 추천 제품
3. 관련상품 목록

1. 서론

마이크로RNA(miRNA)는 약 21-23개의 염기 크기를 가진 단일 가닥 소형 RNA로, 다이서 효소 처리 후 약 70-90개의 염기로 헤어핀 구조를 가진 단일 가닥 RNA 전구체에서 생성됩니다. miRNA는 주로 표적 유전자 mRNA의 3'-단 비코딩 영역에 특이적으로 결합하여 전사 후 표적 유전자 mRNA의 번역 과정을 조절하여 mRNA 번역을 차단하고 mRNA 분해를 촉진하여 단백질 발현을 감소시킵니다. miRNA의 역할은 개체발생, 조직 분화, 세포 증식 및 세포 사멸과 같은 다양한 심혈관 질환의 발생 및 발달에 관여합니다.

그림 1. 생체내 miRNA 합성의 개략도

성숙한 miRNA의 길이는 약 20nt에 불과하며, 일반적으로 전방 프라이머는 전체 길이를 덮거나 심지어 과도한 부분이 있고, 역방향 프라이머는 어디에도 놓일 곳이 없습니다. 현재 시장 솔루션은 역전사 중에 역전사 길이를 늘리는 것입니다. 일반적인 방법으로는 테일링 방법과 스템-루프 방법이 있습니다.

그림 2. 테일링 방법에 의한 miRNA 합성

그림 3. 스템-루프법에 의한 miRNA 합성

테일링 방법은 PolyA 중합효소를 사용하여 성숙 miRNA에 Poly(A) 꼬리를 추가하고, 범용 시퀀스를 갖는 Oligo-dT를 역전사 프라이머로 사용하여 cDNA의 첫 번째 가닥에 해당하는 길어진 miRNA를 합성합니다. 스템-루프 방법은 스템-루프 구조로 접힌 범용 시퀀스를 프라이머로 사용하여 길어진 miRNA에 해당하는 cDNA의 첫 번째 가닥을 합성합니다. 스템-루프 구조는 후속 증폭 과정 동안 적절한 온도에서 열리고 관련 증폭 프라이머와 결합됩니다.

표 1. 테일링과 스템루프의 비교

2. 추천 제품

2.1 Yeasen miRNA tailed inversion 정량적 조합 (11148ES&11171ES)

그림 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA 합성 키트

이 키트는 miRNA 퍼스트 스트랜드 cDNA의 역전사를 위해 테일링 방법을 채택합니다. 제품의 2×Hifair™ miRNA RT 버퍼에는 miRNA 테일링 반응과 역전사 반응을 위한 모든 원료와 프라이머가 포함되어 있으며 신중하게 최적화되었습니다. miRNA 3' 말단의 폴리(A) 변형과 역전사 과정이 동시에 효율적으로 수행되도록 보장할 수 있습니다.

그림 5. 11171ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

miRNA 정량 검출을 위해 특별히 개발된 신세대 사전 혼합 형광 정량 PCR 검출 시약으로, 특수 ROX 수동 참조 염료를 포함하고 있으며, 모든 qPCR 기기에 적합하며, 다른 기기에서 ROX 농도를 조정할 필요가 없으며, 준비 반응에서만 프라이머와 템플릿을 시스템에 추가하여 증폭을 수행할 수 있습니다. DNA 중합효소는 화학적으로 변형된 핫스타트 중합효소를 채택하고 특수 완충액 시스템과 협력하여 반응 특이성과 민감도를 높이고 더 넓은 범위에서 정확하게 정량화할 수 있습니다.

2.2 제품 성능

2.2.1 모든 플랫폼 qPCR 장비와 호환 가능

그림 6. 다양한 qPCR 기기와의 호환 가능한 결과

293T 세포의 Total RNA를 템플릿으로 사용하여 Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Cat# 11148ES)로 역전사를 수행했습니다. 얻은 cDNA를 10배 희석한 다음 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11171ES)를 사용하여 각각 hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p 및 U6의 내부 참조 유전자를 검출했습니다.

2.2.2 높은 검출율, 최대 10 pg

그림 7. 증폭 플롯

그림 8. 증폭 플롯

합성 hsa-miR-let-7e-5p(a) 및 293T 세포 총 RNA(b)를 템플릿으로 사용하여 각각 다음 기울기로 희석했습니다. 60개 사본~606개 사본(6개 기울기) 및 10 pg~100 ng(5개 기울기), Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Cat# 11148ES)로 역전사하고, 생성된 cDNA를 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11171ES)로 검출하여 hsa-miR-let-7e -5p 유전자 발현을 확인했습니다.

2.2.3 높은 특이성, 동일한 패밀리 내 miRNA 간의 단일 염기 차이를 구별할 수 있음

그림 9. miRNA 간 단일 염기 차이 구별

인간 hsa-let-7 패밀리에는 서로 다른 염기가 거의 없거나 심지어 단 하나의 염기 차이만 있는 여러 miRNA가 있습니다. 각 Let-7 동형체(hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98)에 대한 합성 miRNA는 Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Cat# 11148ES)를 사용하여 cDNA로 역전사되었고, Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11171ES)를 사용하여 이러한 miRNA를 다른 프라이머로 개별적으로 증폭하고, 방정식 2-ΔCT x 100%를 사용하여 일치율을 계산했습니다. 결과에 따르면 밀접하게 관련된 하위 유형 패밀리 구성원을 효과적으로 구별할 수 있습니다.

2.2.4 우수한 증폭 효율

그림 10. 증폭 효율

그림 11. 증폭 효율

miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p 유전자는 인간 293T 세포와 마우스 간 총 RNA를 템플릿으로 사용하여 증폭되었습니다. 결과에 따르면 유사한 제품과 비교했을 때 Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Cat# 11148ES)는 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11171ES)의 반응 시스템과 우수한 성능을 보였습니다.

2.2.5 우수한 안정성

그림 12. 37℃에서 7일간의 제품 안정성 분석

그림 13. 50회 동결-해동 사이클 후 결과 분석

그림 14. 24시간 동안 다양한 온도에서 정량 반응 시스템의 안정적인 분석 특성

역전사는 Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Cat# 11148ES)를 사용하여 293T 세포 총 RNA를 템플릿으로 사용하여 수행되었으며, 얻은 cDNA는 10배 희석하여 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11171ES)로 검출했습니다. hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p 발현. △Ct<0.5.

2.3 Yeasen miRNA 스템-루프 역전 정량 조합 (11139ES&11170ES)

그림 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA 합성 키트(gDNA digester plus)

이 키트는 Hifair™ III 역전사효소를 기반으로 개발되었습니다. 효소 cDNA 합성 속도가 빠르고 열 안정성이 크게 향상되었습니다. 동시에 효소는 템플릿과의 친화성을 향상시키고 소량의 템플릿과 저복사 유전자의 역전사에 적합합니다. Hifair™ III 역전사효소가 전체 길이의 cDNA를 합성하는 능력도 향상되어 최대 19.8kb의 cDNA 합성이 가능해졌습니다.

그림 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

이 제품은 SYBR Green I 키메라 형광법을 이용한 miRNA 정량을 위한 특수 마스터 믹스입니다. miRNA 시퀀스는 짧고 동일한 패밀리의 miRNA 시퀀스는 종종 매우 유사하기 때문에 정량화 중에 특이성이 매우 필요합니다. 이 제품은 최적화된 버퍼를 사용한 핫스타트 DNA 중합효소를 기반으로 하며, 비특이적 증폭을 크게 줄일 수 있습니다. 동시에 특수 ROX Reference Dye는 마스터 믹스를 모든 qPCR 기기에 적합하게 만들고, 다른 기기에서 ROX를 조정할 필요가 없습니다. 반응 시스템을 준비할 때 프라이머와 템플릿을 추가하여 증폭을 수행할 수 있습니다.

2.3.1 모든 플랫폼 qPCR 장비와 호환 가능

그림 17. 다양한 qPCR 기기와의 호환 가능한 결과

마우스 간세포의 총 RNA를 템플릿으로 사용하여 Hifair™ III 1st Strand를 사용하여 역전사를 수행했습니다.
cDNA 합성 키트(gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)를 사용하고, 얻어진 cDNA를 40배 희석하여 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)를 사용하여 각각 인간 mmu-miR-125a 유전자를 증폭시켰습니다.

2.3.2 높은 감도, 최대 10 pg

그림 18. 민감도 감지

마우스 간세포의 총 RNA를 템플릿으로 사용하여 Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)로 역전사 반응을 수행하고, 얻은 cDNA를 10배로 연속 희석했습니다(범위 10pg/μL). -0.1 μg/μL), 마우스 유래의 mmu-miR-125a, mmu-miR-132 및 mmu-miR-351 유전자를 증폭했습니다.

2.3.3 높은 특이성, 동일한 패밀리 내 miRNA 간의 단일 염기 차이를 구별할 수 있음

그림 19. miRNA 간 단일 염기 차이 구별

인간 hsa-let-7 패밀리에는 서로 다른 염기가 거의 없거나 심지어 단 하나의 염기 차이만 있는 여러 miRNA가 있습니다. 이러한 miRNA는 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)를 사용하여 다른 프라이머로 별도로 증폭되었으며, 일치율은 2^-Δct x 100% 공식을 사용하여 계산되었습니다.

2.3.4 좋은 반복성

그림 20. 반복성 감지

역전사를 위한 템플릿으로 인간 293T 세포의 총 RNA를 사용하여 Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)를 사용하여 역전사를 수행하였고, 얻어진 cDNA를 50배 희석하여 Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)를 사용하여 90웰 반복 실험에서 인간 hsa-let-7a 유전자를 증폭시켰다.

2.3.5 안정성이 좋음

그림 21. 14일 동안 다양한 온도에서 11170ES의 안정성 분석

그림 22. 11170ES 반복 동결 및 해동 분석

그림 23. 24시간 동안 다양한 온도에서 정량 반응 시스템의 안정된 분석 특성

마우스 간세포의 총 RNA는 Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)를 이용한 역전사를 위한 템플릿으로 사용되었습니다. 얻은 cDNA는 100배 희석하여 마우스 mmu-miR-132 유전자를 증폭시켰습니다.

3. 관련상품 목록

2014년에 설립된 Yeasen Biotechnology(Shanghai) Co., Ltd.는 도구 효소 원료와 항원 항체의 R&D 및 생산에 종사하는 하이테크 기업입니다. 이 회사의 제품에는 제약, 식품 안전 검사, 육종, 사법 및 기타 산업에 사용되는 분자 진단 효소, 단백질 및 항체가 포함됩니다. 우리는 생명 과학 분야의 고객에게 고품질의 제품과 서비스를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다. Yeasen에서 제공하는 관련 제품은 다음과 같습니다.

표 2. 관련제품 목록