팬데믹 동안 좋은 성과를 거두고 큰 잠재력을 보여주었음에도 불구하고 mRNA 기술은 여전히 짧은 발현 시간과 제한된 단백질 번역과 같은 몇 가지 한계가 있습니다. 이러한 특징은 어느 정도 안전을 제공할 수 있지만 단백질 대체와 같은 치료법에 대한 한계가 됩니다. 이를 위해서는 단백질 발현 수준을 유지하기 위해 반복 투여가 필요하여 면역원성 및 중화 항체와 같은 새로운 위험과 과제가 도입됩니다.
자가 증폭 RNA(saRNA)는 기존 mRNA보다 수백 배 또는 수천 배 더 적은 용량으로 동일한 면역 반응을 생성할 수 있습니다. 더 낮은 용량은 더 낮은 생산 비용을 의미하며, 덜 자주 주사하면 mRNA 및 전달 벡터의 잠재적인 독성 부작용을 줄일 수 있습니다. 현재 여러 saRNA 후보가 전 세계적으로 임상 시험에 들어갔습니다. BioNTech와 같은 주요 회사는 saRNA 기술 파이프라인을 적극적으로 개발하고 있습니다.
saRNA는 상당한 비용 및 안전성 이점을 제공하지만, 고유한 구조는 새로운 생산 과제를 제시합니다. RNA 중합효소를 인코딩하는 서열과 표적 단백질 서열을 결합한 saRNA 분자는 전통적인 mRNA보다 훨씬 크고(~10kb) 더 복잡합니다(더 많은 2차 구조 포함). 이는 시험관 내 전사 반응의 어려움을 크게 증가시켜 saRNA 생산의 수율과 순도를 감소시킵니다. 따라서 saRNA 생산은 합성, 분리 및 정제 공정에서 더 높은 표준을 요구합니다.
분리 및 정제에 사용되는 방법인 친화성 크로마토그래피는 낮은 목표 생성물 수율 및 무결성과 같은 문제가 있습니다. 여러 크로마토그래피 정제 방법(예: 셀룰로스 크로마토그래피 추가, 소수성 역상 크로마토그래피)을 결합하는 것은 번거롭고, 새로운 불순물을 도입하고, 회수율이 낮으며, 비용이 많이 듭니다. 또한, 대량 생산에 사용되는 IVT 반응 시스템은 100nt 핵산 서열을 합성하는 데 적합한 시스템에서 최적화되어 있어 크기가 10kb를 초과하는 saRNA에는 적합하지 않습니다. 이는 기존 IVT 반응 시스템의 최적화를 필요로 합니다. 현재 기존 mRNA 정제 방법은 산업용 원액 품질 요구 사항을 충족할 수 없습니다. 따라서 자가 증폭 RNA를 위한 완전하고 효율적인 산업용 분리 및 정제 공정을 개발하고 최적화해야 할 시급한 필요성이 있습니다.
산업 생산 및 정제 방법의 최적화
자가 증폭 mRNA(saRNA)를 위한 산업 생산 시스템을 개발하려면 먼저 소규모로 IVT 공동 전사 시스템의 완충 이온 유형과 구성 요소를 최적화하는 것이 필수적입니다. 여기에는 다운스트림 정제 공정을 위한 크로마토그래피 완충액과 샘플 세척 비율을 정제하는 것도 포함됩니다. 이러한 최적화된 조건을 대규모 생산으로 확장하여 시스템이 생산 용량을 효과적으로 늘리고 원제품의 품질을 개선할 수 있는지 확인할 수 있습니다.
공동 전사 캡 추가 반응 시스템
공동전사 캡 첨가 반응 시스템에서 T7 완충액 성분에는 400mM HEPES, 20mM 스페르미딘, 100mM DTT 및 Mg2+ 염이 포함됩니다.
T7 버퍼 - 마그네슘 이온 소금 유형
사용되는 마그네슘 이온 염의 유형은 표적 saRNA 제품의 수율과 무결성에 영향을 미칩니다.
- 1mg mRNA의 소규모 공동 전사 합성의 경우, Mg2+ 염으로 Mg(OAc)2를 사용하면 각각 100.5µg 및 62.9%의 값으로 가장 높은 수율과 무결성을 얻을 수 있습니다.
- 이와 대조적으로, MgCl2, MgSO4와 같은 다른 마그네슘 이온 염을 사용하면 수율이 약 25-50% 감소하고 완전성은 약 10% 감소하여 수율과 완전성이 모두 현저히 낮아집니다.
T7 버퍼 - 마그네슘 이온 농도
아세트산 마그네슘 이온의 최적 농도(30-50mM)는 표적 saRNA의 수율과 무결성을 향상시키며, 35mM에서 가장 좋은 결과를 얻습니다.
- 아세트산 마그네슘 이온 농도가 30-50mM일 때 saRNA 수율은 88.5-100.5µg에 도달하고, 무결성은 58.6-62.9%로 좋은 결과를 보였습니다.
- 35mM 농도에서는 수율과 완전성이 가장 높아 각각 100.5µg와 62.9%에 도달합니다.
T7 버퍼 - 다른 염과 결합된 마그네슘 이온 염
T7 완충액에 다른 염을 첨가하면 표적 생성물의 수율과 무결성을 크게 향상시킬 수 있습니다.
- 기본 T7 완충액에는 400mM HEPES, 20mM 스페르미딘, 100mM DTT 및 Mg2+ 염이 포함되어 있어 수율과 무결성이 각각 100.5µg 및 62.9%입니다.
- 두 번째 소금인 NaOAc를 첨가하면 수율과 무결성이 더욱 향상됩니다. 수율은 20~110µg 증가하고, 무결성은 약 2~8% 향상됩니다.
T7 완충액 - 결합된 염의 농도
두 번째 소금 성분인 NaOAc(Na+)의 농도가 5-30mM일 때 표적 saRNA 수율과 무결성이 상당히 향상되며, 최적 농도는 15mM입니다.
- Na+ 농도가 3-30mM일 때 saRNA 수율은 120-210µg에 도달하고, 무결성은 64.4-70.2%로 좋은 결과를 보였습니다.
- Na+ 농도가 15mM일 때 수율과 완전성이 가장 높아 각각 210µg와 70.2%에 도달합니다.
단일 정제 방법
소규모(<50mg) saRNA 생산 및 정제 중에 다양한 정제 방법을 사용하면 dsRNA 함량과 단백질 잔류물을 크게 줄여 높은 수율, 캡핑 효율성 및 제품 무결성을 보장할 수 있습니다. 정제 방법의 효과성은 가장 좋은 것부터 나쁜 것까지 다음과 같습니다. 친화 크로마토그래피 > 염화리튬 침전 > 한외여과, 셀룰로스 크로마토그래피.
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친화 크로마토그래피
대규모 mRNA 생산의 경우 크로마토그래피가 선호됩니다. 옵션에는 역상, 이온 교환, 소수성 및 친화성 크로마토그래피가 있으며 각각 장단점이 있습니다. 폴리(A) mRNA를 포획하는 데 자주 사용되는 친화성 크로마토그래피는 >90% 회수율로 확장성과 플랫폼 솔루션을 제공합니다.
mRNA의 주요 구조적 특징인 5' 캡과 3' 폴리(A) 꼬리는 정제를 용이하게 합니다. 자기 비드 정제와 유사한 친화 크로마토그래피는 dT 연결 비드를 사용하여 폴리(A) 꼬리 mRNA를 포획합니다. 고염 조건은 음전하를 보호하여 AT 수소 결합을 통한 결합을 허용하고 mRNA는 온화한 중성 pH와 낮은 전도도에서 용출됩니다.
RNA에 대한 친화 크로마토그래피는 "높은 염 결합, 낮은 염 용출"을 포함합니다. 완충액 구성, 분자 크기, 온도 및 샘플 농도는 프로세스에 상당한 영향을 미칩니다. 실험을 통해 최적의 염 유형과 농도를 선택하는 것은 효율적인 정제에 필수적입니다.
정제: 이 방법은 가장 높은 제품 무결성(80.3%), 가장 낮은 dsRNA 함량(0.01µg/mg), 가장 높은 캡핑 효율(96.4%), 가장 낮은 단백질 잔류물(1.20µg/mg)을 제공하며 수율은 136µg, 회수율은 65%로 제품 순도와 품질 측면에서 가장 우수합니다.
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기타 정화 방법:
염화리튬 침전
LiCl을 사용하여 mRNA를 정제하는 원리는 리튬이 특정 pH에서 분자 간의 정전기적 반발을 줄여 효율적인 RNA 침전을 가능하게 한다는 것입니다. 그런 다음 침전물을 원심분리하여 분리하고 용해하여 순수한 RNA 샘플을 얻습니다. LiCl 침전은 간단하고 빠르며 다양한 크기의 mRNA에 효과적이며 고순도 제품을 생산합니다. 그러나 잔류 리튬 이온은 mRNA를 억제할 수 있습니다. 정제 효율을 보장하기 위해 최소 400µg/ml RNA가 포함된 용액에 LiCl 침전을 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 높은 수율(210µg)을 생성하지만 제품 무결성은 70.2%에 불과하여 제품 품질이 크게 떨어집니다. 대량 생산에는 적합하지 않습니다.
자기 비드 방법 :
자기 비드는 자기장 아래에서 방향적으로 움직이는 작은 입자로, 일반적으로 산화철 코어와 외부 코팅으로 구성됩니다. 자기 비드 정제는 혼합물에서 mRNA 분자를 빠르고 효율적으로 풍부하게 하는 일반적인 분자 생물학 기술입니다. 다양한 기능성 자기 비드는 다양한 생체 분자를 정제하기 위한 다양한 표면 기능 그룹(예: 하이드록실, 카르복실, Oligo(dT), 스트렙타비딘)을 갖습니다.
카르복실화된 자기 비드는 산성 조건에서 정전기적 상호작용을 통해 mRNA 분자가 결합하면서 핵산을 효율적으로 정제할 수 있습니다. 조건을 조정하면 mRNA의 선택적 결합과 방출이 가능합니다. 더 많이 노출된 음전하 인산기가 있는 더 긴 mRNA는 비드에 더 쉽게 결합합니다. 더 짧은 mRNA의 경우 더 큰 비드 볼륨이 필요할 수 있습니다. 친화성 크로마토그래피와 유사한 Oligo(dT) 결합 자기 비드는 mRNA의 폴리(A) 꼬리와 비드의 Oligo(dT) 사이의 특정 결합을 활용합니다.
초여과
이 방법은 친화성 크로마토그래피보다 약 8% 낮은 가장 낮은 saRNA 무결성을 초래하며, 가장 높은 단백질 잔류물(4.58µg/mg)을 초래합니다.
셀룰로오스 크로마토그래피
이 방법은 낮은 dsRNA 함량(0.009µg/mg)과 높은 캡핑율(96.4%)을 달성합니다. 그러나 단백질 잔류물은 약간 더 높고(5.30µg/mg) 회수율은 57%에 불과하고 수율은 120µg로 둘 다 친화 크로마토그래피로 달성한 것보다 상당히 낮습니다(각각 약 10% 및 16µg).
정화 과정
크로마토그래피 완충액 성분 - 환원제 첨가
정제 과정에서 크로마토그래피 완충액에 환원제를 첨가하면 환원제를 첨가하지 않은 경우에 비해 부산물인 dsRNA와 단백질 잔류물 수준을 줄이는 동시에 제품 무결성, 회수율 및 캡핑 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다.
- 환원제 없이:
- 수율 : 136µg
- 회수율 : 65%
- 성실성 : 80.3%
- dsRNA : 0.01µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 1.20µg/mg
- 제품의 순도와 품질이 좋습니다.
- 환원제(TCPE, DTT, β-머캅토에탄올) 사용 시:
- 수확량이 10-40µg 증가
- 회복율이 5-18% 증가합니다.
- 성실도가 약 1-5% 향상됩니다.
- 캡핑 효율 : 96.4%
- dsRNA: 최소 0.005µg/mg
- 단백질 잔류물: 최소 0.20µg/mg
- 제품 순도 및 품질이 크게 향상되었습니다.
크로마토그래피 완충액 성분 - 환원제 종류
크로마토그래피 버퍼에 다양한 유형의 환원제를 첨가하면 dsRNA 및 단백질 잔류물을 줄이는 동시에 제품 무결성, 회수율 및 캡핑 효율을 더욱 개선할 수 있습니다. TCPE가 가장 효과적인 환원제로 밝혀졌습니다.
- TCPE를 사용하는 경우:
- 수율 : 175µg
- 회수율 : 83%
- 성실도 : 85.2%
- dsRNA : 0.005µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 0.20µg/mg
- 제품의 순도와 품질이 우수합니다.
크로마토그래피 완충액 성분 - 환원제 농도
크로마토그래피 완충액에 5-15mM 농도의 환원제를 첨가하면 dsRNA와 단백질 잔류물을 줄이는 동시에 제품 무결성, 회수율 및 캡핑 효율을 크게 개선할 수 있습니다. 최적 농도는 10mM입니다.
- 5-15mM TCPE 추가:
- 수율 : 160-178µg
- 회수율 : 76-85%
- 성실도 : 약 85%
- dsRNA : 0.002-0.005µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 0.20-0.52µg/mg
- 제품의 순도와 품질이 좋습니다.
- 10mM TCPE 사용:
- 수율 : 178µg
- 회수율 : 85%
- 성실도 : 85.4%
- dsRNA : 0.002µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 0.20µg/mg
- 최적의 제품 순도와 품질.
세탁 비율
세척 공정에서 크로마토그래피 완충액과 주입수의 비율을 제어하면(10-25):(75-90) dsRNA와 단백질 잔류물을 줄이는 동시에 제품 무결성, 회수율 및 캡핑 효율을 크게 개선할 수 있습니다. 최적의 비율은 15:85입니다.
- 비율(10-25):(75-90):
- 수율 : 150-179µg
- 회수율 : 71-85%
- 성실도 : 84-90%
- dsRNA : 0.002-0.006µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 약 0.20µg/mg
- 제품의 순도와 품질이 좋습니다.
- 비율 15:85의 경우:
- 수율 : 179µg
- 회수율 : 85%
- 성실도 : 90.0%
- dsRNA : 0.002µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 0.20µg/mg
- 최적의 제품 순도와 품질.
복합 정화 방법
다양한 정제 방법을 조합하여 사용하면 제품 내 dsRNA 및 단백질 잔류물 수준을 더욱 줄여 전반적인 품질을 향상시킬 수 있습니다. 정제 방법의 선호 순서는 다음과 같습니다. 친화성 크로마토그래피 > 초여과 + 친화성 크로마토그래피 > 친화성 크로마토그래피 + 셀룰로스 크로마토그래피 > 셀룰로스 크로마토그래피 + 초여과. 친화성 크로마토그래피만 사용하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.
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친화 크로마토그래피만:
- 수율 : 179µg
- 회수율 : 85%
- 성실도 : 90.0%
- dsRNA : 0.002µg/mg
- 캡핑 효율 : 96.4%
- 단백질 잔류물 : 0.20µg/mg
- 최고의 순도와 품질로 제품을 생산합니다.
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초여과 + 친화 크로마토그래피:
- 수율: 170µg (단독 친화크로마토그래피보다 9µg 적음)
- 회수율: 81% (단독 친화크로마토그래피보다 4% 낮음)
- 성실도 : 88.5%
- dsRNA : 0.0015µg/mg
- 단백질 잔류물 : 0.18µg/mg
- 친화성 크로마토그래피만 사용한 경우에 비해 dsRNA와 단백질 잔류물이 약간 감소하지만 수율과 회수율이 크게 감소합니다. 이 방법은 더 복잡하여 정제 시간이 두 배로 늘어나고 비용이 증가합니다.
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친화 크로마토그래피 + 셀룰로오스 크로마토그래피 / 셀룰로오스 크로마토그래피 + 초여과:
- dsRNA : 단일 방법보다 0.005µg/mg 낮음
- 수율 : 60-100µg 이하
- 회수율 : 30-40% 낮음
- 단계가 늘어나면 노동비와 자재비가 늘어납니다.
대규모 생산
대량 생산에서 친화성 크로마토그래피, 셀룰로스 크로마토그래피와 결합한 친화성 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피와 결합한 초여과를 사용하면 자가 증폭 mRNA의 수율이 140-185µg로 크게 증가하고 회수율은 67-88%입니다. 제품 무결성은 93-94%이고, dsRNA 함량은 0.0018-0.0020µg/mg 이내로 제어되고, 캡핑 효율은 96.1-96.4%에 도달하고, 단백질 잔류물은 0.04-0.05µg/mg 이내로 유지됩니다. 이는 대량 생산에 대한 우수한 확장성과 효율성을 보여줍니다.
참조:
[8] 자가증폭 mRNA 원액의 산업적 생산 및 분리 정제 방법 및 그 응용 [P]. 특허: CN118048418A. 2024.05.17.
주문 정보
| 제품 이름 | 제품유형 | 명세서 |
| CleaScrip™ T7 RNA 중합효소(낮은 ds RNA, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 쿠 |
| T7 RNA 중합효소 GMP 등급(50 U/μL) | 10624ES | 5000/50000유로 |
| T7 RNA 중합효소 GMP등급（250 U/μL) | 10625ES | 10/100 쿠 |
| 10×전사 완충액 2 GMP 등급 | 10670ES | 1/10ml(1/10ml) |
| 피로포스파타제, 무기 GMP 등급 0.1 U/ μL) | 10672ES | 10/100/1000유로 |
| 쥐 RNase 억제제 GMP 등급 | 10621ES | 10/20/100 KU |
| BspQI GMP 등급 | 10664ES | 500/2500유로 |
| DNase I GMP 등급 | 10611ES | 500/2000/10000유로 |
| N1-Me-Pseudo UTP 나트륨 용액(100 mM) | 10651ES | 100 μL/1 mL |
| Hieff NGS™ RNA 클리너 | 12602ES | 1/5/60/450ml |
| ATP Tris Solution GMP 등급(100 mM) | 10652ES | 1/5/25/500ml |
| CTP Tris Solution GMP 등급(100 mM) | 10653ES | 1/5/25/500ml |
| GTP Tris Solution GMP 등급(100 mM) | 10655ES | 1/5/25/500ml |
| 가짜 UTP 트리스 용액 GMP 등급(100 mM) | 10656ES | 1/5/25/500ml |
| N1-Me-Pseudo UTP Tris Solution GMP 등급(100 mM) | 10657ES | 1/5/25/500ml |
| ARCA(안티 리버스 캡 아날로그) | 10681ES | 1/5/25/500ml |
| 이중가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트 | 36717ES | 48톤/96톤 |