Yeasen 과 Molefuture 생명공학의 획기적인 성과
생명공학의 급속한 발전으로, mRNA 치료법은 강력한 프로그래밍 가능성과 빠른 반응 속도로 인해 새로운 치료법으로 주목을 받고 있습니다. mRNA 백신 및 유전자 치료와 같은 분야에서 고품질 mRNA의 효율적인 합성은 치료 목표를 달성하는 데 중요한 단계입니다. 이 과정에서 T7 RNA 중합효소는 mRNA의 시험관 내 합성을 효율적으로 촉매할 수 있기 때문에 중요한 역할을 합니다.
T7 RNA 중합효소의 dsRNA 부산물 문제
T7 RNA 중합효소는 mRNA 합성에서 중요한 역할을 하지만, 실제 작동은 종종 부산물로서 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 생산으로 이어진다. dsRNA의 존재는 mRNA의 수율과 순도를 감소시킬 뿐만 아니라 비특이적 면역 반응을 유발하여 효능과 안전성에 영향을 미칠 수도 있다. 따라서 dsRNA 생산을 줄이는 것이 산업계에서 시급한 요구가 되었다. 현재 dsRNA를 줄이는 방법에는 주로 반응 조건을 최적화하고 보조 효소를 사용하는 것이 있다. 이러한 방법은 어느 정도 dsRNA 생산을 줄일 수 있지만, 종종 복잡한 작동과 비용 증가와 같은 문제가 따른다.
왜 T7 RNA 중합효소 엔지니어링을 해야 하나요?
dsRNA 생산을 줄이기 위해 T7 RNA 중합효소를 직접 변형하는 것이 더 근본적인 해결책입니다. 효소 지향 진화 기술은 효소의 아미노산 서열이나 구조를 정확하게 변경하여 촉매적 특성을 개선하고 제품의 순도와 수율을 높일 수 있습니다. T7 RNA 중합효소의 경우 표적 변형은 dsRNA 생산을 줄일 뿐만 아니라 mRNA 합성의 전반적인 효율성과 품질을 향상시킬 수 있습니다.
mRNA in vitro 합성 원료 공급업체인
dsRNA는 어떻게 생성되나요?
문헌 보고에 따르면, 부산물 dsRNA의 생성은 주로 두 가지 출처에서 비롯됩니다(그림 1): 첫 번째는 T7 RNA 중합효소가 전사 초기 단계에서 개시 형태에서 연장 형태로 전환되는 동안 전사 3중 복합체가 분리되기 쉽고[1], 이로 인해 약 20nt 길이의 짧은 RNA 사슬(Abortive RNA)이 대량으로 시스템으로 방출됩니다. 이러한 RNA 사슬은 긴 RNA 사슬과 상보적 쌍을 이루는 "프라이머" 역할을 하며 T7 RNA 중합효소의 RNA 의존성 RNA 중합효소 활성(RDRP 활성)의 작용으로 dsRNA를 생성합니다[2,3]. 두 번째 출처는 T7 RNA 중합효소가 가지고 있는 말단 리보뉴클레오티드 전이 활성에 의해 촉발됩니다. 전사 반응이 선형 템플릿의 끝에 도달하면 T7 RNA 중합효소는 템플릿 의존성 없이 무작위로 여러 리보뉴클레오티드를 추가할 수 있습니다. "무작위 프라이머"를 형성하는 이러한 리보뉴클레오타이드는 역접힘을 일으키고 표적 mRNA 영역과 상보적으로 쌍을 이루어 dsRNA를 생성하도록 확장될 수 있습니다. 루핑을 통해 생성된 dsRNA를 루프백 dsRNA라고 합니다[3,4]. 따라서 dsRNA 부산물을 줄이기 위해 T7 RNA 중합효소 변형의 초점은 초기 전사 삼중 복합체를 안정화하거나 T7 RNA 중합효소의 말단 전사 활성 및 RNA 의존성 RNA 중합효소(RDRP) 활성을 약화하는 데 있습니다.
그림 1. 에너지 장벽과 dsRNA 형성 원리의 개략도(미공개 자료)
T7 RNA 중합 효소 구조변환 의 에너지 장벽을 극복하는 방법은 무엇인가 ?
구조 및 자유 에너지 분석을 통해 팀은 한편으로는 T7 RNA 중합효소의 구조적 변화와 함께 에너지 변화도 있다는 것을 발견했습니다. 연장 구조의 자유 에너지는 개시 구조의 자유 에너지보다 상당히 높아 전사 과정이 완전한 mRNA 사슬을 생성하기 위해 더 높은 에너지 장벽을 극복해야 함을 나타냅니다. 높은 에너지 장벽은 원활한 구조적 전환에 불리합니다. 따라서 팀은 합리적인 스크리닝 방법을 사용하여 20개 이상의 핫스팟 아미노산을 식별하고 해당 포화 돌연변이 라이브러리를 구축했습니다.
T7 RNA 중합효소의 말단 전이 및 RDRP 활동을 수정하는 방법
반면, T7 RNA 중합효소의 말단 전이 및 RDRP 활성과 관련된 기능, 부위 및 구조적 도메인에 대한 보고가 제한적이고, 기능적으로 유사한 이 두 가지 활성이 T7 RNA 중합효소의 주요 반응인 전사 활성(즉, DNA 의존성 RNA 중합 활성, DDRP)과 주요 부위를 공유할 가능성이 높기 때문에 부위 지향적 수정을 위한 핫스팟 아미노산을 찾는 것이 어렵습니다. 따라서 연구팀은 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 기반으로 여러 개의 무작위 돌연변이 라이브러리를 동시에 구축하고 ZymeEditor 플랫폼의 고처리량 진화 용량과 결합하여 각 라이브러리의 다양성이 10^6을 초과했습니다.
이상적인 T7 RNA 중합효소 의 프로브 기반 발견
T7 RNA 중합효소의 생산을 균형 있게 조절하고 시험관 내 전사 반응에서 dsRNA의 함량을 모니터링하기 위해, 팀은 최적화된 전사 템플릿을 참조하여 표적 mRNA 생성물의 다양한 영역을 표적으로 하는 여러 형광 프로브를 신중하게 설계했습니다. 이러한 프로브는 반응 수율, 무결성, 시스템 내의 dsRNA 함량과 같은 정보를 형광 신호와 연관시킵니다. 시스템의 형광 강도가 강할수록 돌연변이체의 성능이 더 유리합니다. 이론적으로 이 스크리닝 방법은 다양한 프로브의 형광 강도에 따라 돌연변이체를 순위를 매겨 고수율 또는 감소된 Abortive RNA를 갖는 T7 RNA 중합효소 돌연변이체와 향상된 무결성 또는 감소된 루프백 dsRNA를 갖는 돌연변이체를 얻을 수 있습니다. 반응 템플릿을 RNA로 대체하면 RDRP 활성이 감소된 돌연변이체도 음성적으로 스크리닝하여 T7 RNA 중합효소의 템플릿 선택성을 개선할 수 있습니다. 또한, 변형된 뉴클레오타이드와 캡 아날로그를 첨가하고, 드롭릿 반응 시스템에서 반응 온도를 높이는 방식으로 추가적인 스크리닝을 수행하여 비자연적 기질을 견디고 향상된 열 안정성을 나타내는 T7 RNA 중합효소 돌연변이체를 선택할 수 있습니다.
가장 좋은 T7 RNA 중합효소를 스크리닝하는 방법은 ?
라이브러리의 크기에 따라, 팀은 형광 활성화 드롭렛 분류(FADS)를 기반으로 한 초고처리량 스크리닝 프로세스와 전통적인 마이크로플레이트 방법(MTPS)을 기반으로 한 고처리량 스크리닝 프로세스를 개발했습니다. 여러 라운드의 실험을 통해 총 10^7개 이상의 돌연변이체가 스크리닝되어 dsRNA 함량이 상당히 감소된 여러 돌연변이체가 생성되었습니다. 그 중 일부 돌연변이체는 반응에서 Abortive RNA로 인해 dsRNA가 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 이러한 중합효소 돌연변이체의 연장 형태가 더 안정적임을 시사합니다. 일부 돌연변이체는 반응에서 루프백 dsRNA 함량이 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 이러한 돌연변이체에서 말단 전이 활성 또는 RDRP 활성이 약화되었음을 나타냅니다.
앞서 언급한 돌연변이체의 성능 이점이 서로 다른 메커니즘에서 비롯된다는 점을 감안하여, 연구팀은 이를 표적으로 삼는 DNA 셔플링 라이브러리를 구축했습니다. 스크리닝 후, 연구팀은 최종적으로 수율과 mRNA 무결성에 영향을 미치지 않으면서 dsRNA 생성이 극히 낮은 우수한 성능의 돌연변이체를 얻었습니다(그림 2). 그러나 Moderna가 발견한 돌연변이체 G47A+884G의 수율은 영향을 받았습니다 [5] (미발표).
그림 2. 효소 진화 과정 및 돌연변이 성능 특성화
(널리 알려지지 않은)
T7 RNA 중합효소 변이체 에 의한 dsRNA 생성 분석 ?
그림 3에 표시된 바와 같이 공동 전사 캡핑 조건에서 9kb 전사 템플릿을 사용하여 정량 분석한 결과, 야생형 T7 RNA 중합효소는 천연 뉴클레오타이드를 사용할 때 약 2.9ng/μg의 dsRNA를 생산한 반면, 상업용 T7 효소는 약 0.18ng/μg의 dsRNA를 생산했습니다. 그러나 구축된 각 T7 RNA 중합효소 변종의 dsRNA 생산은 0.10ng/μg 미만이었습니다. 특히, 한 변종은 0.015ng/μg에 불과하여 야생형보다 약 200배, 상업용 제품보다 12배 낮았습니다. 반복적인 테스트 후, dsRNA를 줄이는 변종의 성능 이점은 다양한 반응 조건에서 일관되게 관찰되었으며, 이는 이러한 돌연변이체의 우수한 시스템 호환성을 나타내며 반응 완충액 최적화를 통해 dsRNA 생산을 더욱 줄이는 기반을 마련했습니다. 또한 FADS 스크리닝을 통해 제품 무결성과 열 안정성이 향상된 여러 변종을 얻었으며, 이는 더 광범위한 시험관 내 전사 응용 분야의 요구 사항을 충족할 수 있습니다.
그림 3.
현재, 여러 파트너가 이미 T7 RNA 중합효소 변형을 시도했으며, 우리는 그들로부터 높은 평가를 받았습니다. 새로운 효소를 사용하면 mRNA 정제 프로세스가 간소화되고, 작업 효율성이 향상되며, 다양한 적용 시나리오에서 뛰어난 성능을 보여줍니다.
이러한 변형은 특허 출원 중이며 기술 협력 및 라이선스에 대한 논의를 환영합니다.
몰퓨처 바이오테크놀로지 소개
Molefuture Biotechnology는
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다음은
독서에 관하여:
dsRNA 검출 표준화를 촉진하기 위해 이중가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트의 검증 보고서를 공유합니다.
참고문헌:
[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA 중합효소[J]. 핵산 연구 및 분자생물학의 발전, 2003: 1-41.
[2] Steitz T A. 전사 개시에서 연장까지 T7 RNA 중합효소의 구조적 변화[J]. 구조 생물학에 대한 현재 의견, 2009, 19(6): 683-690.