mRNA 시험관 내 전사 중에 잔류 dsRNA를 검출하는 신뢰할 수 있는 방법을 찾고 계신가요? Double-stranded RNA(dsRNA) ELISA 키트보다 더 나은 방법은 없습니다. 그러나 여러 상용 키트가 출시됨에 따라 검증 데이터가 항상 공개적으로 제공되지 않을 수 있으며, 이로 인해 dsRNA 검출에 일관성이 없을 수 있습니다. 따라서 특이성, 정밀도, 정확도, 민감도 및 내구성을 다루는 Double-stranded RNA(dsRNA) ELISA 키트의 검증 보고서를 공유합니다. 이 보고서는 특정 실험 조건 및 규제 약전 표준에 맞게 조정된 dsRNA 잔류 검출 방법을 검증하기 위한 참고 가이드 역할을 합니다. dsRNA 검출 표준화를 촉진하기 위해 검증 보고서에 대해 자세히 알아보세요.
이중가닥 RNA(dsRNA) ELISA K it
배경:
이중 가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트는 mRNA 시험관 내 전사 과정에서 생성된 잔류 dsRNA를 검출하도록 설계된 시약 키트입니다. 이중 항체 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 검사(ELISA)와 바이오틴-스트렙타비딘 증폭 시스템의 실험 원리를 활용하여 이 키트는 샘플에서 잔류 dsRNA를 민감하게 검출합니다.
요약 데이터에는 특이성, 정밀도, 정확도, 민감도 및 내구성을 포함하는 검증 매개변수가 포함되어 있습니다. 이 보고서는 참조 가이드 역할을 하며, 사용자에게 특정 실험 조건에 맞게 조정되고 규제 약전 표준을 준수하는 dsRNA 잔류 검출 방법을 검증하도록 촉구합니다.
재료 및 방법:
키트: 이중 가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트: Cat#36717ES(YEASEN) . 이 키트에는 네 가지 유형의 dsRNA 표준 샘플이 포함되어 있습니다. 사용자는 표준 곡선을 생성하기 위한 특정 프로세스에 맞는 표준 샘플 유형을 선택할 수 있으므로 모든 샘플을 준비하고 테스트할 필요가 없습니다.
방법: 실험에 필수적인 재료와 절차 단계는 주로
결과
- dsRNA 표준의 선형성
이 보고서는 각각 300bp 길이의 네 가지 유형의 dsRNA 표준에 대한 표준 곡선을 개발했습니다. 이러한 표준에는 STD1, 변형되지 않은 dsRNA; STD2, Pseudo-UTP 변형 dsRNA; STD3, N1-Me-Pseudo-UTP 변형 dsRNA; STD4, 5-OMe-UTP 변형 dsRNA가 포함됩니다. 각 유형의 dsRNA 표준은 R2 > 0.99 및 측정 농도의 변동 계수(CV)가 10% 미만인 우수한 희석 선형성을 나타냅니다(표 1~표 5 참조).
|
성병 이름 |
UTP 유형 |
희석의 선형성(R 2 " > 0.99) |
이력서 |
|
성병1 |
유티피(UTP) |
0.0156-1 pg/ μL |
< 10% |
|
성병2 |
한국어: |
0.0156-1 pg/ μL |
< 10% |
|
성병3 |
N1-Me-pUTP |
0.0312-1 pg/ μL |
< 10% |
|
성병4 |
5-OMe-UTP |
0.0625-1 pg/ μL |
< 10% |
표 1. 다양한 dsRNA 표준의 선형성.
|
STD1 농도 ( pg / μL ) |
측정된 평균 ( pg/μL ) |
회복 |
이력서 |
|
1 |
1.0001 |
100.0% |
3.1% |
|
0.5 |
0.4994 |
99.9% |
2.4% |
|
0.25 |
0.2516 |
100.7% |
3.3% |
|
0.125 |
0.1227 |
98.1% |
0.5% |
|
0.0625 |
0.0640 |
102.5% |
3.2% |
|
0.0312 |
0.0309 |
99.2% |
1.3% |
|
0.0156 |
0.0157 |
100.4% |
3.2% |
|
0 |
/ |
/ |
/ |
표 2. 희석된 STD1의 회수율 및 CV
|
STD2 농도 ( pg / μL ) |
측정된 평균 ( pg/μL ) |
회복 |
이력서 |
|
1 |
1.0001 |
100.0% |
0.7% |
|
0.5 |
0.4994 |
99.9% |
0.1% |
|
0.25 |
0.2514 |
100.6% |
0.9% |
|
0.125 |
0.1232 |
98.6% |
2.5% |
|
0.0625 |
0.0635 |
101.6% |
1.1% |
|
0.0312 |
0.0312 |
99.9% |
0.5% |
|
0.0156 |
0.0155 |
99.6% |
0.0% |
|
0 |
/ |
/ |
/ |
표 3. 희석된 STD2의 회수율 및 CV
|
STD3 농도 ( pg/μL ) |
측정된 평균 ( pg/μL ) |
회복 |
이력서 |
|
2 |
2.0031 |
100.2% |
1.6% |
|
1 |
0.9880 |
98.8% |
2.4% |
|
0.5 |
0.5188 |
103.8% |
1.2% |
|
0.25 |
0.2383 |
95.3% |
2.2% |
|
0.125 |
0.1242 |
99.4% |
0.1% |
|
0.0625 |
0.0629 |
100.7% |
1.8% |
|
0.0312 |
0.0361 |
115.7% |
1.6% |
|
0 |
/ |
/ |
/ |
표 4. 희석된 STD3의 회수율 및 CV
|
STD4 농도 ( pg/μL ) |
측정된 평균 ( pg/μL ) |
회복 |
이력서 |
|
4 |
4.0096 |
100.2% |
1.9% |
|
2 |
1.9940 |
99.7% |
0.7% |
|
1 |
0.9977 |
99.8% |
0.1% |
|
0.5 |
0.5108 |
102.2% |
0.1% |
|
0.25 |
0.2454 |
98.2% |
5.6% |
|
0.125 |
0.1207 |
96.5% |
2.8% |
|
0.0625 |
0.0624 |
99.9% |
0.3% |
|
0 |
/ |
/ |
/ |
표 5. 희석된 STD4의 회수율 및 CV
-
특성
- dsRNA, ssRNA, dsDNA 및 ssDNA를 사용한 특이성 분석.
- 특이성은 dsRNA의 길이에 영향을 받지 않았습니다.
-
정확성
dsRNA 함량이 0.36 pg/μL인 알려진 mRNA 샘플에 0.5 pg/μL의 STD1을 추가하는 것은 세 가지 다른 부피 비율(1:1, 1:20, 1:250)로 수행되었습니다. 모든 경우에서 스파이크 회수율은 80-120% 범위 내에 있었습니다.
스파이크 회수율은 다음과 같이 계산됩니다. 스파이크 회수율 = (스파이크 후 측정된 농도 × 스파이크된 샘플의 총 부피 - 샘플의 측정된 농도 × 샘플의 총 부피) / (스파이크의 이론 농도 × 스파이크의 부피) × 100%
|
샘플 |
STD1/샘플의 부피 비율 |
측정된 dsRNA(pg/μL) |
스파이크 회복율 |
|
샘플(TS) |
/ |
0.36 |
/ |
|
TS+0.5pg/μL 표준1 |
1：1 |
0.769 |
81% |
|
TS+0.5pg/μL 표준1 |
1：20 |
0.777 |
82% |
|
TS+0.5pg/μL 표준1 |
1：250 |
0.803 |
82% |
표 6. 스파이크 회복율 분석
-
정도
- 시험 내 정밀도
실험은 4개의 dsRNA 표준 샘플 각각에 대해 3가지 농도 수준(높음, 중간, 낮음)에서 수행되었습니다. 단일 실험 내에서 각 농도 샘플은 8번의 반복 테스트를 거쳤습니다. 결과에 따르면 변동 계수(CV)가 15% 미만으로 우수한 검정 내 정밀도를 나타냅니다.
|
성병1 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
복제하다 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
1 |
8 |
1.0002 |
3.11% |
|
0.125 |
8 |
0.1230 |
0.46% |
|
0.0156 |
8 |
0.0164 |
3.18% |
|
성병2 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
복제하다 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
1 |
8 |
1.0001 |
0.65% |
|
0.125 |
8 |
0.1231 |
2.46% |
|
0.0156 |
8 |
0.0162 |
0.02% |
|
성병3 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
복제하다 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
2 |
8 |
2.0022 |
1.58% |
|
0.25 |
8 |
0.2444 |
2.17% |
|
0.0312 |
8 |
0.0328 |
1.64% |
|
성병4 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
복제하다 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
8 |
8 |
8.0803 |
0.27% |
|
1 |
8 |
0.9650 |
0.12% |
|
0.125 |
8 |
0.1322 |
2.76% |
표 7. 시험 내 정밀도 분석
- 시험 간 정밀도
3개 배치의 키트를 사용하여 3개 실험을 수행했습니다. 각 실험에서 고농도, 중농도, 저농도를 선택하여 4개의 dsRNA 표준 샘플 각각에 대해 3번씩 테스트했으며, 8번 반복했습니다. 결과적으로 각 농도 수준에서 24개 데이터 포인트를 획득한 다음 변동 계수(CV) 분석에 사용했습니다. 결과에 따르면 표준의 각 농도에 대한 CV는 15% 미만이었습니다.
|
성병1 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
독립 테스트/복제 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
1 |
3/8 |
1.0007 |
2.38% |
|
0.125 |
3/8 |
0.1186 |
3.20% |
|
0.0156 |
3/8 |
0.0173 |
1.27% |
|
성병2 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
독립 테스트/복제 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
1 |
3/8 |
0.9987 |
0.09% |
|
0.125 |
3/8 |
0.1269 |
1.06% |
|
0.0156 |
3/8 |
0.0151 |
0.52% |
|
성병3 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
독립 테스트/복제 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
2 |
3/8 |
2.0012 |
2.37% |
|
0.25 |
3/8 |
0.2415 |
0.14% |
|
0.0312 |
3/8 |
0.0330 |
1.81% |
|
성병4 |
|||
|
이론 농도 (pg/μL) |
독립 테스트/복제 |
측정된 평균(pg/μL) |
이력서 |
|
8 |
3/8 |
7.9735 |
1.89% |
|
1 |
3/8 |
1.0225 |
0.13% |
|
0.125 |
3/8 |
0.1227 |
5.63% |
표 8. 시험 간 정밀도 분석
-
감광도
- 로드(LOD)
키트의 검출 한계는 블랭크 값의 평균에 표준 편차의 두 배를 더하여 결정됩니다. 24개 블랭크의 OD를 측정하고, 평균과 표준 편차를 계산한 다음, 이러한 값을 적합 곡선에 적용하여 해당 검출 한계를 얻습니다.
|
오디세이 |
||||
|
dsRNA 표준 |
공백의 평균 |
SD의 공백 |
Blank의 평균+2SD |
로드(LOD) |
|
성병1 |
0.016 |
0.00048 |
0.01696 |
≤0.001pg/μL |
|
성병2 |
0.016 |
0.00072 |
0.01744 |
≤0.001pg/μL |
|
성병3 |
0.034 |
0.00119 |
0.03638 |
≤0.001pg/μL |
|
성병4 |
0.115 |
0.00290 |
0.1208 |
≤0.01pg/μL |
표 9. LOD 분석
- 수량
키트의 정량 한계는 표준 곡선의 가장 낮은 농도점을 훨씬 더 낮은 수준으로 희석하여 설정되며, 가장 낮은 농도에서 CV < 20%를 보장하여 정량 임계값을 정의합니다. LOQ는 다음과 같습니다.
|
dsRNA 표준 |
수량 |
복제하다 |
이력서(%) |
회복 (%) |
|
성병1 |
0.0156pg/μL |
24 |
＜10% |
80~120% |
|
성병2 |
0.0312pg/μL |
24 |
＜10% |
80~120% |
|
성병3 |
0.0156pg/μL |
24 |
＜10% |
80~120% |
|
성병4 |
0.125pg/μL |
24 |
＜10% |
80~120% |
-
내구성
- IVT 재료에 대한 간섭 방지
이 테스트의 목적은 mRNA 샘플에 첨가된 다양한 효소, 완충액 등이 키트에 의한 dsRNA 검출에 미치는 영향을 평가하는 것입니다.
제공된 mRNA 샘플에 특정 농도의 T7 RNA 중합효소, RNAse Inhibitor, IPPA(무기 피로포스파타제), DNase I, VCE(백시니아 캡핑 효소), 2'-O-Methyltransferase(MT), 1×IVT 완충액, 1mM 구연산나트륨을 첨가한 다음, 표준 곡선 준비와 샘플 테스트에 STD3를 활용함으로써 키트가 이러한 샘플에서 dsRNA 함량을 검출하는 능력을 평가할 수 있었습니다. 결과는 8가지 다른 효소와 완충액의 존재가 dsRNA의 정확한 검출에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 또한, 관찰된 회수율은 80%~120% 범위 내에 있었습니다.
|
IVT 자료 |
dsRNA 측정(pg/μL) |
회복 |
|
없음 |
0.6057 |
100% |
|
T7 RNA 중합효소(15μg/mL) |
0.5411 |
89.32% |
|
쥐 RNase 억제제(27.5μg/mL) |
0.5142 |
84.88% |
|
무기 피로인산가수분해효소(IPPA 10μg/mL) |
0.7132 |
117.7% |
|
DNase I (13.75μg/mL) |
0.6077 |
100.32% |
|
바키니아 캡핑 효소(10μg/mL) |
0.6563 |
108.3% |
|
2´-O-메틸트랜스퍼라제(10μg/mL) |
0.5776 |
95.4% |
|
1×IVT 버퍼 |
0.5003 |
82.6% |
|
1mM 구연산나트륨 |
0.6251 |
103.2% |
표 11. IVT 물질을 첨가한 희석된 STD3의 회수율
- 온도 내구성
키트는 7일 후 dsRNA 표준의 농도 분산을 감지하기 위해 4°C와 37°C에서 보관되었습니다. 결과는 분산이 모두 20% 이내임을 보여줍니다.
|
dsRNA 표준 |
dsRNA 측정(pg/μL) Day 0 |
4°C에서 7일 후의 변화 |
|
성병1 |
1 |
10% |
|
성병2 |
1 |
5% |
|
성병3 |
2 |
7% |
|
성병4 |
4 |
11% |
|
dsRNA 표준 |
dsRNA 측정(pg/μL) |
37°C에서 7일 후의 변화 |
|
성병1 |
1 |
18% |
|
성병2 |
1 |
4% |
|
성병3 |
2 |
5% |
|
성병4 |
4 |
8% |
표 12. 온도 내구성 분석
관련 제품:
| 제품 이름 | 제품유형 | 명세서 |
| 이중가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트 | 36717ES | 48톤/96톤 |
| CleaScrip™ T7 RNA 중합효소(낮은 ds RNA, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 쿠 |
| T7 RNA 중합효소 GMP등급（250 U/μL) | 10625ES | 10/100 쿠 |
관련 자료:
이중 가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트는 J2 항체 도트 블로팅 방법과 함께 낮은 dsRNA T7 RNA 중합효소 돌연변이의 검증을 위해 사용되었습니다.
낮은 dsRNA T7 RNA 중합효소 돌연변이, mRNA 백신 및 치료 개발 강화
참고문헌:
- ICH, 2022: 분석 방법 검증 Q2, 초안 버전.
- NMPA, 2007: 생물학적 제품 품질 관리 분석을 위한 분석 방법 검증 평가를 위한 일반 원칙
- 중국 약전위원회(ChPC), 2020: 중국 약전, 4부: 생물학적 샘플에 대한 정량 분석 방법 검증 지침