HCP 탐지의 개념 및 필요성
생물학적 제품은 일반적으로 숙주 세포(예: 박테리아, 효모, 포유류, 곤충 또는 식물 세포)에서 재조합 기술을 사용하여 생산되며, 여기에는 단일 클론 항체, 재조합 단백질 및 백신이 포함됩니다. 이러한 제품의 제조 및 정제 공정은 불가피하게 숙주 세포 단백질(HCP)을 불순물로 도입하는데, 여기에는 숙주 세포의 구조 단백질과 숙주 세포에서 분비되는 성장 인자가 모두 포함되어 다양한 물리화학적 및 면역학적 특성을 가진 복잡한 혼합물을 형성합니다. 고급 정제 기술을 사용했음에도 불구하고 일부 숙주 세포 단백질은 여전히 중간 약물 제품에서 공정 관련 불순물로 남아 있을 수 있습니다.
이러한 불순물은 잠재적인 면역원성을 가지고 있으며 생물약학 제품의 면역원성 반응을 증가시켜 안정성과 효능에 영향을 미쳐 인체 안전에 위험을 초래할 수 있습니다. 따라서 HCP 제거를 위한 적절한 모니터링 전략을 수립해야 하며 최종 제품의 HCP 함량을 제어하여 약물 품질 요구 사항을 충족해야 합니다.
HCP에 대한 규제 요구 사항
생물학적 제품의 HCP 잔류 함량은 일반적으로 제품의 중요 품질 속성(CQA), 공정 견고성 모니터링을 위한 중요한 평가 지표, 제품의 핵심 품질 관리 지표로 간주됩니다. 다양한 국가의 규제 기관은 HCP에 대한 규정을 가지고 있으며, 생물제약품을 분석하고 정제하여 숙주 세포 단백질 HCP를 허용 가능한 수준으로 낮추도록 요구합니다. HCP의 허용 수준은 특정 상황에 따라 평가되며, 용량, 투여 빈도, 약물 유형, 질병의 심각도를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.
중국 약전(2020년판)에서는 다음과 같이 규정하고 있습니다: CHO 세포의 경우 잔류 HCP는 <0.05%(500 ppm 미만에 해당)이어야 하며, 대장균의 경우 잔류 HCP는 <0.01%이어야 합니다.
미국 약전 USP <1132> 장에서는 다음과 같이 명시하고 있습니다: 약물에서 HCP를 검출하기 위해서는 매우 민감한 방법을 사용해야 하며, 그 함량은 검출 한계(일반적으로 100 ppm 미만, 즉 총 단백질 1mg 중 HCP 함량은 100 ng 미만 또는 <0.01%)여야 합니다.
유럽 약전 EP 2.6.34에서는 다음과 같이 명시하고 있습니다: 생물학적 제품의 경우 HCP 함량은 0.1% 미만이어야 합니다.
인체용 의약품 등록 기술 요건 조화에 관한 국제 회의(ICH) 지침: ICH Q6B에서는 잔류 HCP를 모니터링하기 위해 민감하고 검증된 방법을 채택해야 하며, 일반적으로 잔류량이 100 ppm 미만이어야 한다고 명시합니다.
규제 기관이 HCP에 대해 매우 일관된 요구 사항을 가지고 있음을 알 수 있습니다. 생물학적 제품의 공정 개발은 HCP 검출을 거쳐야 하며, 정제 공정이 HCP를 안전한 수준으로 줄일 수 있음을 입증해야 하며, 최종 제품의 잔류 함량에 대한 권장 한도는 중국과 미국에서 모두 0.01% 미만입니다.
HCP 감지 방법
효소결합면역흡착검사(ELISA)는 현재 HCP 검출에 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 중국 약전 2020년판 3412/3413/3414장에 언급된 숙주 단백질 잔류물 검출 방법은 모두 ELISA 방법입니다.
미국 약전 USP <1132> 장에서는 전기영동, ELISA, LC-MS/MS와 같은 방법을 사용하여 HCP 함량을 검출할 수 있다고 언급하고 있으며, ELISA는 조작이 쉽고, 속도가 빠르고, 감도가 높고, 처리량이 높아 HCP 검출을 위한 선호되는 방법으로 권장됩니다.
엘리사:
목적: HCP에 존재하는 단백질의 총량을 검출하고, 제품 개발과 공정 제어에 활용할 수 있으며, 현재 HCP를 검출하는 일반적인 방법입니다.
장점: 민감도와 특이성이 높습니다. 처리량과 자동화 기능이 뛰어납니다. 정량적입니다. 작업이 쉽고 빠릅니다.
단점: 특정 항체가 필요합니다. 개별 HCP를 구체적으로 식별하고 평가할 수 없습니다. 방법 개발이 복잡하여 특수 항원 준비가 필요합니다. 방법에 영향을 미치는 요인이 많고 HCP 적용 범위를 평가해야 합니다. 종을 식별할 수 없습니다.
웨스턴 블로팅:
목적: 대량의 샘플을 일관되게 스크리닝하고 항-HCP 항체와 반응하는 알려지지 않은 단백질을 검출하는 데 사용됩니다. HCP를 검출하고 HCP의 상대 분자량에 대한 대략적인 정보를 제공하는 데 적합합니다.
장점: 특이성; 결과가 시각적으로 직관적임: 단백질 크기와 발현 수준의 차이를 시각화함; 특정 HCP를 검출하고 정량화할 수 있음.
단점: 반정량적; 특정 단백질에 국한됨: 항체에 결합된 HCP만 감지할 수 있음; 복잡한 단백질 혼합물에는 민감도가 충분하지 않음; 단백질 SDS 변성으로 인해 구조적 에피토프가 손실될 수 있음; 민감도는 다클론 항체의 품질에 따라 달라짐.
2차원 젤 전기영동(2-DE):
목적: 일반적으로 상류 또는 하류 공정 개발 및 특성화에 사용되며 단일 젤에서 다양한 HCP를 구별할 수 있습니다.
장점: 웨스턴 블로팅이 필요 없으므로 전이 문제가 발생하지 않습니다. 제품에서 미량의 HCP 불순물을 분리할 수 있습니다. 상대 분자량과 등전점에 대한 대략적인 정보를 제공합니다.
단점: 과도한 단백질로 인해 HCP 반점이 가려질 수 있음, 샘플 내 HCP 분포를 관찰할 수 있지만 정량화할 수 없음.
질량 분석법:
목적: 개별 HCP를 식별하여 숙주 세포 단백질에 대한 정확한 식별 및 정량화 정보를 제공합니다.
장점: 높은 분해능과 정확성; 개별 HCP를 식별하고 모니터링; HCP의 포괄적인 스펙트럼 제공; 광범위한 단백질을 다룰 수 있음; HCP 종을 식별할 수 있음.
단점: 높은 장비 및 기술적 요구 사항, 복잡한 작업, 높은 비용, 낮은 방법 처리량, 복잡한 샘플 전처리, 잠재적인 매트릭스 효과, 전문적인 데이터 분석 역량 필요.
ELISA는 다양한 국가의 약전에서 생물학적 제품의 잔류 HCP를 검출하는 데 권장되는 방법으로, HCP의 총량을 결정할 수 있습니다. 그러나 HCP의 유형과 풍부도를 식별하는 데 한계가 있으며 다른 방법으로 보완해야 합니다. 각 검출 방법에는 장단점이 있으며 실제 적용에서는 실험 목적, 샘플 특성, 정확도 및 운영 편의성 등의 요인을 기반으로 선택할 수 있으며, 다양한 방법을 사용하여 보다 포괄적이고 정확한 결과를 얻을 수 있습니다.
또한, 미국 약전 USP <1132> 및 유럽 약전 EP 2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS는 제품 개발의 다양한 단계에서 HCP 검출을 위해 다양한 ELISA 시약을 사용해야 하며, HCP 검출 방법을 상용 시약, 제품/공정별 방법 및 플랫폼 방법으로 분류해야 함을 나타냅니다.
USP <1132>에서는 플랫폼 방법이 없는 경우 상용 시약을 전임상, 1상 및 2상 임상 시험에 사용할 수 있다고 언급합니다. 3상 임상 시험/공정 검증 및 시판 후 제품의 경우 상용 일반 HCP 검출 시약의 항체 적용 범위가 부족한 것과 같은 한계로 인해 세포 유형 및 공정 특이성과 같은 요소를 고려하여 상류 공정 개발을 위해 플랫폼 방법이나 제품/공정별 방법을 사용해야 합니다.
그림 1. USP <1132>에서는 제품 개발의 여러 단계에서 HCP를 감지하기 위한 특정 방법을 사용하도록 제안합니다.
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방법 |
상업용 시약 키트 |
제품/프로세스별 감지 키트 |
플랫폼 감지 키트 |
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유효성 |
쉽게 이용 가능 |
숙주 세포주 복제를 포함한 항원 준비가 필요합니다. |
누드 또는 빈 벡터 세포주를 사용하여 항원을 준비해야 합니다. |
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개발 |
최소한의 준비만 필요합니다 |
항원 특성화, 면역화 및 확인을 포함한 탐지 개발에는 일반적으로 최소 6개월이 소요됩니다. |
항원 특성화, 면역화 및 확인을 포함한 탐지 개발에는 일반적으로 최소 9개월이 소요됩니다. |
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다양성 |
가장 일반적인 표현 시스템에 한정됨 |
다양한 유형의 표현 시스템을 사용할 수 있습니다. |
다양한 유형의 표현 시스템을 사용할 수 있습니다. |
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특성 |
특이성이 낮을 수 있으며 잠재적으로 감지되지 않은 HCP가 있을 수 있습니다. |
특이성은 일반적으로 향상되며 항체 적용 범위는 특정 HCP 패턴을 타겟으로 합니다. |
상용 검출 방법에 비해 특이성이 향상되고 검출 성능에 대한 이해가 강화되며 HCP 유형에 대한 적용 범위도 증가합니다. |
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비용 |
초기 가격은 비교적 저렴하지만 하류 정제 프로세스 전체에 대한 개발 비용은 빠르게 증가할 것입니다. |
초기 비용은 더 높지만 손익분기점은 일반적으로 시약 키트 100세트의 가치입니다. |
다양한 제품에 적용 가능하기 때문에 비용 측면에서 상당한 이점이 있습니다. |
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의존 |
특정 공급업체에 따라 시약과 제어 계획은 "블랙박스" 상태에 있습니다. |
모든 시약 및 완충액에 대한 포괄적인 제어가 가능하며 언제든지 조정이 가능합니다. |
모든 시약에 대한 완전한 소유권과 통제력을 갖고 있어 공급망과 배치 비교의 위험을 줄입니다. |
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규제 요구 사항 |
마케팅 승인 신청 지원에 적합하지 않습니다. |
라이선스 제품의 초기 개발부터 마케팅까지 전체 프로세스 지원에 적용 가능 |
마케팅 승인까지 초기 개발 지원에 적용 가능 |
표 1. 다양한 HCP 시약 키트 유형의 비교
Yeasen Biotech 맞춤형 HCP 분석 개발 서비스
HCP 검출의 중요성을 감안하여,
사용자 정의 타임라인
숙주세포 잔류 단백질 검출 키트의 맞춤형 서비스는 일반적으로 6~10개월이 소요됩니다.
항원-항체 제조: HCP 항원을 결정하고, HCP 참조 표준을 확립하고, 면역 경로 및 전략을 고안하고, HCP 항체를 제조하는 작업에는 일반적으로 4~6개월이 걸립니다.
검정 키트 개발: 항체 최적화, 커버리지 분석, 검정 키트 방법 검증 등은 일반적으로 2~4개월이 소요됩니다.
Yeasen Biotech HCP 항체 적용 범위 검증 서비스
ELISA가 업계에서 잔류 HCP를 검출하는 데 있어 황금 표준이라는 것은 알려져 있지만, 이 방법의 정확도는 HCP에 대한 다중 클론 항체의 적용 범위에 따라 달라집니다. 미국 약전과 유럽 약전은 면역 정제와 2D-WB를 HCP ELISA 항체와 그 적용 범위를 특성화하는 권장 방법으로 언급합니다.
HCP 항체 적용 범위 검증 서비스
2D-WB는 먼저 2차원 겔 전기영동을 사용하여 단백질을 크기와 전하를 기준으로 분리한 다음, 이 단백질을 멤브레인으로 옮겨 HCP 항체와 함께 배양하여 단백질 각인을 검출합니다.
당사는 CHO, E.coli, HEK293 등과 같은 숙주 세포의 HCP 샘플에 대한 항체 적용 범위 검증 서비스를 제공하기 위해 2D-WB 계측 장비와 광범위한 실험실 경험을 갖추고 있습니다.
관련 제품:
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제품 |
카탈로그 번호 | 크기 |
| 36712ES | 48톤/96톤 | |
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36713ES |
48톤/96톤 | |
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CHO HCP ELISA 키트(CHO-K1) |
36714ES |
48톤/96톤 |
| 대장균 HCP ELISA 키트(플라스미드) | 36721ES | 48톤/96톤 |