최근 몇 년 동안 mRNA 기반 약물은 상당한 주목을 받고 연구의 초점을 맞추었습니다. T7 RNAP는 단순성과 시험관 내에서 높은 수율과 충실도로 RNA 합성을 촉매하는 능력으로 유명합니다. 그러나 전사 과정에서 T7 RNAP는 중단된 짧은 RNA, 조기 종료된 RNA 및 3'-확장된 RNA와 같은 부산물을 생성할 수 있으며, 이는 dsRNA 형성에 유리한 조건을 만듭니다. 따라서 dsRNA 생성을 줄이는 것이 실제 응용 분야에서 시급한 필요성이 되었습니다.
최근, " FADS와 준합리적 설계로 변형된 T7 RNA 중합효소는 dsRNA 생성을 감소시켰고, 말단 전이효소와 RDRP 활동은 낮았다 "라는 제목의 획기적인 연구가
T7 RNAP의 FADS 기반 스크리닝
T7 RNAP 스크리닝을 위해 단백질 진화의 고처리량 요구 사항을 충족하기 위해 FADS(Fluorescence-activated droplet sorting)가 선택되었습니다. 세포의 조기 단편화를 방지하기 위해 연구자들은 이중 수용액 상을 갖는 PDMS 칩을 사용했으며, 여기서 리소자임은 칩 상의 세포와 혼합되어 물방울 내에서 활성을 발휘했습니다 (그림 1) . 연구자들은 10 5 ~ 10 6 범위의 다양성을 갖는 여러 무작위 돌연변이 라이브러리를 생성했습니다. 스크리닝 후 10개의 우성 변이체를 식별하여 Mut1~Mut10으로 지정했습니다. 그림 2E 및 그림 2F 에서 볼 수 있듯이 Mut1, Mut7 및 Mut9의 dsRNA 함량은 야생형보다 상당히 낮았습니다.
그림 1. FADS 개요
그림 2. 무작위 라이브러리 스크리닝 및 변형 평가
T7 RNAP의 준 합리적 설계
연구자들은 반-합리적 설계 탐색을 수행하고, 10개의 단일 사이트 포화 라이브러리를 생성하고, 스크리닝을 위해 전통적인 마이크로티터 플레이트 기반 듀얼 프로브 방법을 채택했습니다( 그림 3 ). 추가된 5'-단 프로브는 RNA 수율 감지에 사용됩니다.
그림 3. 감소된 dsRNA를 위한 구조-지침 반-합리적 설계
연구자들은 1000개가 넘는 돌연변이체를 스크리닝한 후, Mut11(K180E), Mut12(S228F), Mut13(G238L), Mut14(A70Q), Mut15(A383H), Mut16(I743L)의 여섯 가지 후보체를 식별했습니다. 여섯 가지 돌연변이체의 총 RNA 수율은 야생형과 크게 다르지 않아 비슷한 전체 전사 효율을 나타냈습니다. 예상대로 Mut11과 Mut14의 dsRNA 함량은 야생형에 비해 상당히 낮았습니다( 그림 4 ).
그림 4. 마이크로티터 플레이트 스크리닝 및 변형 평가
DNA 셔플링에서 나온 Mut17은 dsRNA를 덜 생성합니다.
T7 RNAP를 더욱 최적화하기 위해 생산 요건을 충족하는 동시에 dsRNA 함량이 낮은 4가지 변이체를 선택했습니다. 그런 다음 연구자들은 DNA 셔플링 라이브러리를 구축하고 마이크로티터 플레이트로 스크리닝하여 부모 T7 RNAP에 비해 dsRNA 생산이 낮은 변이체를 식별했으며, 이를 Mut17(A70Q/F162S/K180E)이라고 명명했습니다. 그런 다음 Mut17과 부모 변이체(Mut14, Mut11 및 Mut7)의 전사 산물을 분석했습니다. 그림 5 에서 볼 수 있듯이 4가지 변이체 모두 야생형에 비해 전사 중 dsRNA 생산이 상당히 감소했습니다. 놀랍게도 Mut17은 스크리닝 용매 시스템에서 dsRNA 함량이 단 1.80%로 상당히 낮았고 최저 0.007 ng/μg였습니다.
그림 5. Mut17 및 부모 돌연변이의 dsRNA 함량
돌연변이체의 IVT 제품의 면역원성은 야생형의 IVT 제품의 면역원성보다 현저히 낮습니다.
다음으로, 우리는 쥐 RAW264.7 세포에서 IVT 제품의 면역원성을 평가했습니다. 그림 2A 및 2B에서 볼 수 있듯이, IFN-β mRNA와 단백질 수치는 야생형과 비교하여 돌연변이체에서 생성된 mRNA로 형질감염된 RAW264.7 세포에서 감소하였는데, 이는 야생형 T7 RNAP에 의해 합성된 mRNA가 가장 강한 면역 반응을 유발한 반면 돌연변이체의 mRNA는 상당히 감소된 반응을 보였다는 것을 나타냅니다. 구체적으로, Mut11 RNA로 처리한 세포의 IFN-β mRNA는 야생형으로 처리한 세포의 9.7%에 불과했고 단백질은 12.93 pg/mL이었습니다. 더욱이, EGFP의 발현은 다른 T7 RNAP에 의해 생성된 mRNA 사이에서 양이나 질에 있어서 유의미한 차이를 보이지 않았으며 (그림 6C) , 산업적 적용 요건을 충족했습니다.
그림 6. 포유류 세포의 IFN-β 반응 및 EGFP 발현
돌연변이체의 RDRP와 말단 전이효소 활동은 야생형보다 훨씬 낮 습니다 .
돌연변이가 dsRNA를 감소시키는 영향을 조사하기 위해 연구자들은 이 모든 돌연변이에 대한 실리코 연구를 수행했습니다. 결과는 변형체에서 RDRP 활동이 감소했음을 분명히 나타냅니다. 변형체는 RNA를 템플릿으로 사용하는 경향이 감소했기 때문입니다. 마찬가지로 이는 T7 RNAP의 말단 전이효소 활동에 영향을 미쳤을 수 있습니다. 그림 7 에서 볼 수 있듯이, 다양한 농도에서 4가지 변형체 모두 야생형에 비해 형광 값이 50% 미만이었습니다.
그 후, 3'-단 이질성 검정을 사용하여 T7 RNAP의 말단 전이 활성을 특성화했습니다. 말단 전이효소 활성을 반영하는 n>0인 RNA의 비율에 초점을 맞추었을 때, 연구자들은 이러한 RNA가 야생형에서 82.94%를 차지하는 반면 돌연변이체는 다음과 같은 백분율을 나타냄을 발견했습니다: Mut11(70.29%), Mut7(67.88%), Mut14(63.31%), Mut17(55.62%) (그림 8 ) . 중요한 점은 이러한 백분율이 제품 내 dsRNA의 풍부함과 매우 일치한다는 것입니다 (그림 5) . 이러한 결과는 돌연변이체의 말단 전이효소 활성이 상당히 감소했음을 나타내며, 이는 RDRP 활성의 감소와 함께 dsRNA의 감소에 기여합니다. 구체적으로, 말단 전이효소 활동은 더욱 중요한 역할을 할 수 있으며, 이는 Mut17에서 관찰된 가장 낮은 n>0 RNA 축적에서 입증됩니다. 또한 Mut17은 가장 낮은 dsRNA 생성량을 보입니다 (그림 5 및 그림 8 ) .
그림 7. 상대적 RDRP 활동
그림 8. RNA 생성물의 3'-단의 이질성
결론
이 연구는 dsRNA 함량이 감소된 돌연변이체를 식별하기 위한 강력한 방법론을 제공하고 RNA 의존성 RNA 중합효소와 말단 전이효소 활성이 감소된 여러 dsRNA 돌연변이체를 성공적으로 분리합니다. mRNA 치료제에 필수적인 안전성과 효능의 검증을 크게 강화하여 mRNA 백신과 유전자 치료 응용 프로그램을 발전시키는 데 중요한 의미를 강조합니다.
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