차세대 시퀀싱(NGS)은 높은 검출 감도, 강력한 특이성, 정성적 및 정량적 검출을 모두 수행할 수 있는 능력으로 인해 병원체 검출, 종양 돌연변이 검출 및 생식 유전학과 같은 분야에서 매우 광범위한 임상 및 과학적 연구 응용 전망을 보여주었습니다. NGS의 핵심 단계인 라이브러리 구축은 시퀀싱 품질에 직접적인 영향을 미칩니다. 체외 진단(IVD) 제품에 대한 등록 검토 지침에 따라 주요 원자재의 연구 데이터를 제공해야 합니다. 기본 정보, 매개변수 지표 및 원자재 공급원과 같은 요소를 결합하여 포괄적인 분석 및 검증을 수행하여 가장 적합한 원자재 공급원을 결정해야 합니다. 기존의 DNA 및 RNA 라이브러리 구축 프로세스는 주로 cDNA 합성, DNA 단편화, 어댑터 연결 및 라이브러리 증폭과 같은 주요 단계를 포함합니다. 다양한 단계에는 많은 유형의 원자재 효소가 포함됩니다. 원자재 효소의 스크리닝은 연구 주기를 연장합니다. 이를 바탕으로 비용 효율적이고 간단한 라이브러리 구축 모듈 제품이 IVD 제품 개발을 위한 새로운 선택이 되었습니다.
그림 1. Illumina 플랫폼을 예로 들어 기존 DNA 라이브러리 구축 프로세스(좌)와 RNA 라이브러리 구축 프로세스(우)
역전사 합성은 RNA-Seq의 핵심 부분으로, 고감도, 고수율의 cDNA, 복잡한 구조의 템플릿과의 호환성과 같은 여러 기능을 통합한 새로운 유형의 고효율 역전사 효소는 연구 핫스팟입니다.
그림 2. RNA-seq에 적용된 13488ES의 성능
시퀀싱 플랫폼의 짧은 읽기 길이에 의해 제한을 받는 DNA는 라이브러리 구축 전에 무작위로 단편화되어야 합니다. 초기에는 균일성과 편향 문제로 인해 효소 단편화가 어려웠습니다.
그림 3. 다양한 DNA 단편화 효소의 단편화 효과: 강력하게 작용하는 단편화 효소(좌) 및 약하게 작용하는 단편화 효소(우)
라이브러리 변환율은 라이브러리 품질을 평가하는 데 중요한 지표입니다. 어느 정도 높은 라이브러리 변환율은 더 나은 라이브러리 풍부성과 시퀀싱 데이터의 더 나은 균일성을 의미합니다. 기존의 T4 DNA 리가제는 고효율 라이게이션 최적화에 초점을 맞추지만, 단편은 자가 라이게이션되기 쉽고, 이는 라이브러리 변환율을 감소시키고 라이브러리 풍부성과 시퀀싱 품질에 영향을 미칩니다.
그림 4. 12996ES 의 열 안정성 및 링커 잔류물 분석
PCR 증폭 효소는 모두 NGS 라이브러리 제조 방법에 필요합니다. 대부분의 고충실도 DNA 중합효소는 5'→3' 중합효소 활성과 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있습니다. 잘못 통합된 염기를 교정하면서 5'→3' 방향으로 DNA를 합성할 수 있으므로 DNA 단편을 빠르고 고충실도로 증폭할 수 있습니다. 그러나 NGS를 위해 특별히 설계된 효소는 거의 없습니다. 효율적이고 정확하며 특이적이며 편향 없이 다양한 크기와 GC 함량의 타겟을 증폭할 수 있고 동시에 프라이머를 미리 혼합할 수 있는 라이브러리 증폭 제품은 많지 않습니다.
그림 5. 12980ES의 안정성 및 증폭 오류율 분석
위의 NGS 라이브러리 구축 모듈 제품 시리즈 외에도, 우리는 또한 원스톱 원시 효소 제품을 제공하여 다양한 고객의 결합된 요구를 충족합니다.
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제품 카테고리 |
제품 이름 |
제품번호 |
주목 |
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효율적인 cDNA 합성 |
Hifair™ Ultra 역전사효소（200 U/μL） |
14604ES |
역전사효소 |
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Hieff NGS™ ds-cDNA 합성 키트 |
13488ES |
cDNA 합성 모듈 |
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DNA 단편화 및 최종 복구 및 A-테일링 |
히프™ 스메라제 |
12907ES |
DNA 단편화효소 |
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12619ES |
DNA 단편화 및 최종 복구 및 A-테일링 모듈 |
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수리 및 A-테일링 |
Hieff NGS® 고속 엔드 리페어/dA-테일링 모듈 |
12608ES |
End-Repair & A-Tailing 모듈 |
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어댑터 결찰 |
10299ES |
T4 DNA 리가제 |
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도서관 확대 |
2× Ultima HF 증폭 믹스 |
13344ES |
고성능 효소 |