오르가노이드 연구 Q&A: 알아야 할 모든 것

오르가노이드에 대한 연구가 심화됨에 따라 이에 참여하는 개인들이 늘어나고 있다. 이 글에서는 오르가노이드에 대한 일반적인 지식 몇 가지를 요약하여 [1-5], 모든 사람에게 도움이 되기를 바란다.

질문: 오르가노이드는 단일 유형의 세포로 구성되어 있나요, 아니면 다세포 조직으로 구성되어 있나요?

오르가노이드는 성체 줄기세포 또는 다능성 줄기세포의 시험관 내 3차원(3D) 배양을 통해 형성되며, 특정 공간적 조직을 가진 조직과 같은 구조가 생성됩니다. 오르가노이드는 단일 세포로 구성된 구조가 아니라 줄기세포 특성을 가진 개시 세포의 분열과 분화를 유도하여 형성되며, 이후 생체 내 해당 장기와 유사한 특정 공간적 구조, 형태 및 기능을 가진 조직으로 자체 조립됩니다.

 

질문: 오르가노이드를 배양하는 데 사용되는 공급원은 무엇입니까?

(1) 다능성 줄기세포로부터 유래된 오르가노이드에는 성체줄기세포(ASC), 다능성 줄기세포(PSC), 유도다능성 줄기세포(iPSC)가 포함됩니다. (2) 조직추출세포로부터 유래된 오르가노이드는 종양조직에서 흔히 발견됩니다.

 

질문: 신선한 조직이 없는 경우에도 동결 조직을 3D 배양에 사용할 수 있나요?

네, 하지만 동결 조직의 크기에 대한 요구 사항이 더 높고, 1차 동결 조직과 세포의 생존력이 크게 감소하여 후속 배양에서 성공률이 크게 낮아집니다.

 

질문: 오르가노이드는 어떻게 동결되고 소생되나요?

오르가노이드를 동결하는 최적의 시기는 오르가노이드의 활동과 분화 잠재력이 가장 좋은 2-5번째 패시지입니다. 오르가노이드의 소생은 세포 소생에 사용되는 방법을 따를 수 있습니다.

 

질문: 배양된 유기체의 크기를 조절하는 것이 필요한가요? 그리고 유기체가 너무 큰 경우 유익할까요?

네, 오가노이드는 내부 혈관과 기액 순환 시스템이 없기 때문에 크기를 조절하는 것이 필요합니다. 오가노이드의 크기가 클 때, 중심부 근처의 세포는 외부 환경과 산소와 영양소를 교환하는 데 어려움을 겪습니다. 따라서 구조가 클수록 죽은 세포의 수가 많아집니다.

 

질문: 매트릭스 젤을 사용하는 것 외에 오가노이드를 배양하는 데 무엇을 사용할 수 있나요?

매트릭스 젤 이외에, 오르가노이드 배양을 위한 대안으로는 (1) 세포 제거된 세포외 매트릭스 및 기타 유래 단백질, (2) 합성 하이드로젤, (3) 엔지니어링된 재조합 단백질 젤이 있습니다.

 

질문: 유기체의 지시적 분화는 어떻게 달성될 수 있나요?

오르가노이드에서 줄기세포 유도 분화의 초기 발달은 여러 신호 전달 경로에 의해 공동으로 조절됩니다. 시험관 내 배양에는 이러한 신호 전달 경로의 활동을 시뮬레이션하여 세포가 특정 방향으로 분화되도록 안내하는 성장 인자를 추가해야 합니다. 예를 들어, Y27632와 Activin A로 유도하면 배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC)를 배아체(EB)로 분화할 수 있습니다. 그 후, 신호 전달 경로는 Wnt3a, FGF-4, Noggin과 같은 인자에 의해 조절되어 특정 방향으로 줄기세포 분화를 유도합니다.

질문: 임상 샘플을 채취할 때 오염을 어떻게 피할 수 있나요?

(1) 가능한 한 무균 샘플링을 실시한다. (2) 추출 전 항생제가 포함된 PBS에 몇 분간 담근다. 위, 장, 방광 등 외부 환경과 접촉할 가능성이 있는 부위에 위치한 종양의 경우 항생제가 3%-5% 포함된 PBS에 5-10분간 담그는 것이 좋다. 기타 일반적인 종양의 경우 항생제가 1%-2% 포함된 PBS에 약 5분간 담가둔다. (3) 세포 추출 시 사용하는 모든 시약에는 항생제가 1% 포함되어야 하며 적절한 농도의 1차 항생제가 포함되어야 한다.

 

질문: 종양 조직의 채취, 보관, 운반 시 어떤 예방 조치를 취해야 합니까?

가능한 한 종양 세포 함량이 높은 종양 조직을 수집하고, 조직 샘플이 공기에 노출되는 시간을 최소화하여 오염 가능성을 줄입니다. 수집된 종양 조직 샘플을 가능한 한 빨리 특수 샘플 보존 용액이 들어 있는 멸균 튜브에 넣고 저온(약 4°C)에서 검사 장치로 신속하게 운반합니다(샘플링 후 2~4시간 이내에 배송하도록 노력).

 

질문: 병변에서 배양한 오르가노이드와 인접 조직에서 배양한 오르가노이드 사이에 차이가 있습니까?

종양 조직의 샘플링 부위에 대한 요구 사항은 무엇입니까? 네, 차이가 있습니다. 종양 자체가 이질성을 나타내므로 다른 출처에서 유래한 오르가노이드 간에 차이를 관찰하는 것이 일반적입니다. 형태학적으로, 1차 병변에서 유래한 오르가노이드는 인접 조직에서 유래한 오르가노이드에 비해 더 침습적인 구조를 갖는 경향이 있으며 일반적으로 더 불규칙해 보입니다. 모델링 또는 약물 스크리닝에서 오류를 최소화하려면 활동이 좋은 부위에서 여러 샘플을 채취해야 합니다.

 

질문: 종양 기관체의 약물 감수성 검사에 어떤 종류의 약물을 사용할 수 있나요?

임상에서 사용되는 주요 항암제의 종류는 크게 세 가지로 나눌 수 있다. 세포독성 약물(파클리탁셀, 시스플라틴/카보플라틴, 5-FU 등), 표적 약물(EGFR, HER2, VEGFR 등을 표적으로 하는 약물), 면역 체크포인트 억제제(PD-1 항체, PD-L1 항체 등)로 대표되는 면역 요법 약물이다.

 

질문: PDO 배양의 성공률은 얼마입니까?

PDO 배양의 성공률은 출처에 따라 약간씩 다릅니다. 대부분의 PDO는 63%에서 70% 사이, 심지어 더 높은 90%까지 성공률을 보이는데, 이는 조직 자체의 활동과 크게 관련이 있습니다. 또한 임상 치료가 성공률에 영향을 미칠 수 있습니다. 조직 체외 배양 및 운영 단계의 시간을 줄임으로써 성공률을 개선할 수 있습니다.

 

질문: 냉동 조직을 오르가노이드 배양에 사용할 수 있나요?

일반적으로 조직 냉동보존은 생존력의 상당한 손실로 인해 권장되지 않습니다. 그러나 조직을 -80°C에서 보관하는 경우, 오르가노이드 배양을 위한 최적의 기간은 보존 후 6주 이내입니다. 조직을 액체 질소에 보관하는 경우 보존 기간은 더 길어질 수 있지만 바람직하게는 6개월을 초과하지 않습니다.

Q: 일차세포를 추출할 때 일반적으로 섬유아세포가 섞여 있습니다. 어떻게 처리해야 합니까?

(1) 섬유아세포의 접착력이 약하기 때문에 반복적인 접착을 통해 제거가 가능하다. (2) 섬유아세포 제거시약을 사용할 수 있으나, 세포소기관의 배양에 영향을 미치는지 여부는 실험적 검증이 필요하다.

 

질문: 종양 오르가노이드를 배양하는 데 얼마나 많은 원래 종양 조직이 필요합니까? 생검 샘플이 충분합니까?

일반적으로 수술 조직은 콩 2~3개 크기보다 커야 하며, 바늘 생검을 통해 얻은 경우 최소 2~3개의 샘플이 필요하고, 내시경 생검을 위해서는 최소 6개 이상의 종양 조직을 고정해야 합니다.

 

질문: 종양 조직의 샘플이 너무 적고, 배양된 오르가노이드의 수가 후속 검사를 수행하기에 충분하지 않은 경우, 어떻게 해야 합니까?

종양 출처에서 유래된 오르가노이드는 계대배양 후 표현형 차이가 나타날 수 있으므로 일반적으로 계대는 권장되지 않습니다. 문헌에서는 오르가노이드의 계대를 2~3세대로 제한하고 최대 5세대로 제한하는 것이 권장됩니다. 세포 수가 너무 적어 5세대 후에도 테스트 요구 사항을 충족할 수 없는 경우, 더 작은 384웰 플레이트를 사용하거나 마이크로유체 칩을 사용하여 테스트하는 등 테스트 방법을 변경하는 것을 고려하세요.

 

Q: 종양 조직에 정상 세포가 있을까요? 이 정상 세포를 제거하는 방법은?

정상 세포가 소수 있을 수 있습니다. 첫째, 수집하는 동안 정상 조직을 샘플링하지 않도록 하십시오. 둘째, 일차 세포를 추출한 후 추가 오르가노이드 배양에 자기 비드 분류 또는 유세포 분석을 사용할 수 있습니다. 매우 적은 수의 정상 세포가 있는 경우 후속 오르가노이드 모델링 및 배양에 큰 영향을 미치지 않으므로 제거할 필요가 없을 수 있습니다.

 

질문: 종양 조직에서 일차세포를 추출할 때, 세포가 붉은색으로 보이는 이유는 무엇입니까?

조직은 생체 내 혈액 공급이 풍부하므로 적혈구가 많습니다. 대부분의 경우 처리가 필요하지 않으며 오르가노이드 배양에 영향을 미치지 않습니다. 적혈구가 너무 많으면 배양 전에 용해 완충액으로 적절히 처리할 수 있습니다.

 

Q: 오르가노이드 배양 중에 검은 입자가 발견됩니다. 어떻게 제거합니까?

검은색 입자는 불순물이나 세포 파편일 가능성이 가장 높습니다. 이는 두 가지 방법으로 제거할 수 있습니다.

유기체를 분해한 후, 배지로 반복해서 씻어 불순물을 희석합니다.

멸균 수술용 칼을 사용하여 오르가노이드를 절반으로 자른 다음, 배지로 채운 1ml 주사기를 사용하여 오르가노이드에서 불순물을 조심스럽게 씻어냅니다.

 

Q: 오르가노이드 배양의 통과 횟수에 제한이 있나요? 그리고 통과 횟수는 몇 번까지 가능하나요?

일반적으로 통과 횟수는 소스 세포의 특성에 따라 달라집니다. 대부분의 오르가노이드는 최대 10회(>6개월) 동안 시험관 내에서 통과될 수 있습니다. 배양 조건의 선택도 어느 정도 영향을 미칠 수 있으며, 일반적으로 조건화된 배지가 합성 인자 배지보다 우수합니다.

 

질문: 종양 세포주(HepG2 세포주 등)를 PDO로 배양할 수 있나요?

PDO는 복잡하게 자체 조립된 구조입니다. 단일 세포주에 의해 형성된 3D 배양 시스템은 PDO라고 부를 수 없습니다. 이는 단순히 3D 구형 상태라고 합니다.

 

질문: 오르가노이드를 통과시키는 기준은 무엇인가요?

유기체의 발달 상태에 따라 시간은 달라지며, 보통 5-10일 사이이고 직경은 약 100-200μm입니다. 느리게 발달하는 일부 유기체는 적절한 통과 상태에 도달하는 데 몇 주가 걸릴 수 있습니다.

 

질문: 생존 가능한 유기체의 수를 어떻게 세나요?

실험 중에 미리 준비한 Calcein-AM 보관 용액을 꺼내고 Calcein-AM 용액을 배지에 넣어 최종 농도가 0.2μmol/L이 되도록 합니다. 37°C에서 60분간 배양합니다. 시간이 지나면 Calcein-AM이 포함된 배지를 PBS로 천천히 씻어내고 새로운 배지를 넣습니다. 여기 파장이 490nm, 방출 파장이 515nm인 형광 현미경을 사용하여 오가노이드를 관찰하고 사진을 찍습니다. 살아있는 오가노이드는 녹색으로 보이고 가장자리가 선명합니다. 직경이 20μm 이상인 오가노이드를 센다.

 

질문: 오르가노이드의 생존력을 계산하는 방법은 무엇인가요?

오르가노이드의 생존율은 다음 공식에 따라 계산됩니다. X=(Nlive/Ntotal)×100%, 여기서 X는 오르가노이드의 생존율을 나타냅니다. Nlive는 살아있는 오르가노이드의 수를 나타냅니다. Ntotal은 오르가노이드의 총 수를 나타냅니다.

 

질문: 유기체를 식별하는 방법은 무엇인가요?

가장 기본적인 방법은 현미경으로 오르가노이드의 형태를 관찰하고 H&E 염색을 실시하는 것입니다. 다른 방법으로는 Western Blot, qRT-PCR, 면역 형광, 유세포 분석이 있으며 오르가노이드가 해당 바이오마커를 발현하는지 감지합니다. 유전자 시퀀싱은 배양된 오르가노이드와 출처 조직 간의 유전적 일치를 식별할 수 있습니다. 일부 오르가노이드의 경우 기능 검사를 수행하여 특정 기능을 가지고 있는지 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 연구에 따르면 위 오르가노이드는 위산을 분비할 수 있고 심장 오르가노이드는 자율적으로 박동할 수 있습니다.

 

Q: 정상 세포도 오르가노이드로 자랄 수 있나요? 종양 오르가노이드 배양 중에 정상 오르가노이드를 제거하는 방법은 무엇인가요?

정상 세포도 오르가노이드로 자랄 수 있습니다. 정상 오르가노이드를 제거하는 방법은 다음과 같습니다. (1) 현미경으로 HE 염색 결과를 기반으로 한 수동 선택; (2) 배양 배지의 구성을 조정하여 PDO 정제(성장 인자/소분자 억제제 등); (3) 유세포 분석 또는 자기 비드 분류를 위해 PDO를 단일 세포로 분산.

 

질문: 약물 민감성 실험 중에 PDO를 매트릭스 젤에서 소화해야 합니까?

아니요, PDO는 생체 내 조건을 시뮬레이션하기 위해 3차원 구조가 필요합니다. 매트릭스 젤의 지지가 없으면 약물 감수성 실험의 정확도가 영향을 받습니다. 일반적으로 가용성 약물은 매트릭스 젤을 관통하여 오르가노이드에 작용할 수 있지만 면역세포화학 실험을 수행할 때는 매트릭스 젤을 제거해야 합니다.

 

질문: PDO 실험이 동물 모델(PDX)을 완전히 대체할 수 있나요?

PDO는 PDX를 부분적으로 대체할 수 있지만, 완전히 대체할 수는 없습니다.

 

질문: 이전 조건에 비해 성장 주기가 짧아지고 증식이 빠른 특징을 보이는 PDO가 배양 중에 비정상적으로 성장하는 이유는 무엇일까요?

외부 요인: (1) 이 이상은 섬유아세포와 같은 특정 오염 세포의 광범위한 성장으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 경우 절편 염색 및 관찰을 수행하여 이러한 오염 세포의 존재를 확인한 다음 제거하는 것이 좋습니다. (2) 특정 요소 또는 소분자의 첨가를 포함한 배양 조건의 변화는 PDO의 증식 경로를 더욱 활성화할 수 있습니다.

내부 요인: 유전적 돌연변이 가능성. 이를 확인하기 위해 시퀀싱이 권장되며, 결과를 주요 PDO의 결과와 비교하여 유전적 돌연변이가 있는지 확인해야 합니다.

 

질문: PDO의 약물에 대한 민감성은 어떻게 테스트할 수 있나요?

PDO는 CCK8 분석, ATP 세포 생존력 분석 및 생존/사멸 염색과 같은 방법을 사용하여 약물 민감성을 테스트할 수 있습니다. 종양 기관체의 ATP 활동을 평가하는 것이 가장 일반적인 방법입니다. ATP는 세포에서 가장 중요한 에너지 분자이며 세포 대사 수준을 측정하는 데 사용할 수 있으며, 생존 가능한 세포의 수를 반영합니다. 약물 투여가 세포 ATP 함량에 미치는 영향을 기반으로, 각 약물 요법에 대한 IC50 값(테스트된 약물의 반최대 억제 농도)을 분석 소프트웨어를 사용하여 계산하여 종양 억제에 가장 효과적인 약물을 선택할 수 있습니다.

 

질문: PDO의 약물 감수성 실험 농도 범위는 1차 종양 세포의 농도 범위와 동일합니까?

아니요, 동일하지 않습니다. 일반적으로 PDO의 약물 농도는 일차 세포의 약물 농도보다 높아야 합니다. 공식적인 약물 감수성 실험에 대한 최적 농도를 분석하기 위해 예비 실험을 수행할 수 있습니다.

 

질문: 약물 테스트에는 어떤 성장 단계에서 오르가노이드를 사용해야 합니까?

일반적으로 약물 검사를 위해 5회 통과 이내의 오르가노이드를 사용하는 것이 권장됩니다. 이 단계에서 오르가노이드는 가장 좋은 안정성과 활성을 보입니다.

 

Q: 오르가노이드 구축의 성공을 판단하는 기준은 무엇인가요?

(1) 초기 예비 평가: 세포 상태에서 소포, 새싹, 밀집 또는 느슨한 형태로 유기체 형태가 변화합니다. (2) 조직 슬라이스의 분포와 유사해야 하는 특정 바이오마커 발현의 식별. 더 자세한 비교를 위해 추가 시퀀싱 분석을 수행할 수 있습니다.

 

질문: 오르가노이드 배양은 일반 세포 배양과 어떻게 다릅니까?

(1) 다양한 세포 배양 방법: 오르가노이드는 3차원 구조를 유지하기 위해 기질이나 공간 구조의 지지가 필요한 반면, 일반적인 세포 배양은 이것이 필요하지 않습니다. (2) 오르가노이드 배양은 체외 분화와 자가 조립을 달성해야 하므로 유도를 위해 다양한 사이토카인의 조합을 사용해야 하므로 비교적 복잡한 배양 배지 구성 요소가 필요합니다. 일반적인 세포 배양은 일반적으로 단일 유형의 세포만 포함하므로 배양 배지 구성 요소는 비교적 간단합니다. (3) 다양한 세포 출처: 오르가노이드는 다능성 상피 세포에서 유래하는 반면, 일반적인 세포 배양은 다양한 유형의 선택된 세포를 배양하는 데 적합합니다.

 

질문: 제가 배양한 3D 구체가 유기체인지, 그리고 표적 조직과 일치하는지 어떻게 확인할 수 있나요?

오르가노이드를 식별하는 방법에는 H&E 염색, 면역조직화학(IHC), 단일 세포 시퀀싱 등이 있습니다. 형태학적, 조직병리학적, 분자유전학적 관점에서 다차원적 판단을 내려 표적 장기 또는 조직과 일치하는지 확인하는 것이 필요합니다. 종양 오르가노이드의 경우 특정 바이오마커를 감지하여 확인할 수 있습니다.

 

질문: 배양 중 관찰된 유기체의 형태가 문헌에 보고된 것과 다르다면, 그 이유는 무엇일까요?

첫째, 샘플 소스와 하위 유형의 개인 차이와 이질성이 존재할 수 있습니다. 둘째, 유도에 사용된 선택된 사이토카인과 일부 소분자 억제제의 품질 차이로 인해 다른 오르가노이드의 분화 형태가 달라질 수 있습니다. 문헌 설명에만 의존하기보다는 HE 염색, IHC 및 유전자 시퀀싱과 같은 방법을 통해 오르가노이드 형태와 소스 조직 간의 일관성을 확인하는 것이 좋습니다.

 

질문: 오르가노이드로 약물 감수성 실험을 할 때, 약물의 용매로 사용하는 DMSO의 양을 조절해야 합니까?

네, 일반적으로 약물 감수성 실험에서는 DMSO의 부피 백분율이 0.5% 미만이어야 합니다.

 

질문: 매트릭스 젤에서 오르가노이드를 어떻게 회수할 수 있나요?

다음 방법을 권장합니다: (1) 상업적으로 이용 가능한 오르가노이드 회수 용액(CAT#41421ES)을 사용하면 세포나 세포 표면 단백질을 손상시키지 않고 부드럽고 효과적으로 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. (2) 매트릭스 젤을 낮은 온도에서 해동하여 부드럽게 만들고 오르가노이드를 방출할 수 있습니다.

 

질문: 많은 오르가노이드가 회수 중에 원심분리관 벽에 달라붙습니다. 회수율을 어떻게 개선할 수 있습니까?

수집 후 원심분리할 때는 수평 로터 원심분리기를 사용하고 원심분리 속도를 적절히 높입니다. 일반적으로 약 300g의 원심력과 약 1000-1200rpm의 속도가 적합합니다.