1. 낮은 전사 수율

템플릿의 품질은 수율과 밀접한 관련이 있습니다. 실험군의 수율이 대조군보다 상당히 낮은 경우, 가능한 이유는 다음과 같습니다.

① 실험 템플릿에는 억제 구성요소가 포함되어 있습니다.

② 템플릿에 오류가 있습니다.

제안:

① 템플릿을 재정제합니다.

② 템플릿 정량화 및 무결성을 확인합니다.

③ 반응시간을 늘리세요.

④ 템플릿 입력량을 늘려주세요.

⑤ 다른 프로모터와 RNA 중합효소를 시도해 보세요.

2. 짧은 필사본의 낮은 수확률

짧은 전사 개시 단편은 반응을 억제합니다. 전사 산물이 100nt 미만인 경우 반응 시간을 4-8hs로 늘리거나 템플릿 양을 2μg로 늘리면 RNA 수율이 증가합니다.

3. RNA 전사 길이가 예상보다 길다

전기영동 결과 제품 밴드가 예상 크기보다 큰 경우 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다.

①플라스미드 템플릿은 완전히 선형화되지 않을 수 있습니다.

② 센스 가닥의 3' 말단은 눈에 띄는 구조를 가지고 있다.

③RNA는 완전히 변성되지 않은 2차 구조를 가지고 있다.

제안:

①템플릿이 완전히 선형화되었는지 확인하고, 필요한 경우 추가 선형화를 수행합니다.

② 3'오버행을 피하기 위해 적절한 제한 효소를 선택하거나, Klenow Fragment/T4 DNA polymerase를 사용하여 전사를 완료한 후 진행합니다.

③ 변성 젤을 사용하여 RNA 생성물을 검출합니다.

4. RNA 전사 길이가 예상보다 짧습니다.

전기영동 결과 제품 밴드가 예상 크기보다 작은 경우 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다.

①템플릿은 T7 RNA 중합효소와 유사한 종결 서열을 포함합니다.

②템플릿의 GC 함량이 높다.

제안:

① 반응 온도를 낮춥니다(예: 30°C). 때로는 온도를 낮추면 전사 길이가 늘어날 수 있지만 수율이 감소합니다. 또는 전사를 위해 다른 RNA 중합효소를 시도합니다.

②템플릿 GC 함량이 높을 경우 42℃로 전사를 진행하거나 SSB를 첨가하여 수율과 전사 길이를 증가시킨다.

5. 전사산물의 전기영동 꼬리

전기영동 중에는 테일링 현상이 발생합니다.

가능한 이유:

①실험 진행 중 RNase에 의해 오염됨

②RNase에 의한 DNA 템플릿 오염.

제안:

① RNase가 없는 피펫 팁과 EP 튜브를 사용하고, 일회용 라텍스 장갑과 마스크를 착용하며, 모든 시약은 RNase가 없는 H2O로 준비합니다.

②템플릿 DNA를 다시 정제한다.

[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al. Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8)은 숙주 Bombyx mori에서 BmPEX16 유전자 발현을 조절하여 곰팡이 병원성을 증가시킵니다. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. 삼중 가닥 변위 증폭 카스케이드를 이용한 순환 miR-195-5p의 초고감도 정량화. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)