SYBR Green 염색을 기반으로 한 Hieff ^™ Fast Cell Direct RT-qPCR 키트는 RNA를 추출할 필요 없이 모든 종류의 동물 세포(세포 계통 벽 세포 및 현탁 세포, 일차 배양 세포, 다양한 줄기 세포, iPS 세포 등)에서 RNA를 추출하는 데 적합하며, qPCR 발현 분석에 직접 사용할 수 있으며, 짧고 조작이 간편하며 오류율이 낮습니다. 템플릿 준비부터 역전사 반응 및 유전자 발현 분석까지 단계를 완료하는 데 불과 1.5시간이 걸립니다.

역전사 분석 및 형광 검출 시약이 키트에 포함되어 있어 추가 시약을 구매하지 않고도 유전자 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

명세서

구성 요소

저장

FCD Lysis Buffer와 FCD Washing Buffer는 오염을 방지하기 위해 녹여서 4°C에 보관했습니다. FCD Stop Solution、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix는 -25~-15℃에 보관해야 합니다.

지침

1. 분열 생성물의 제조

1)1. 시약을 실온에서 녹인 후, 사용 전 뒤집어서 가볍게 섞은 후, 거품이 생기지 않도록 가볍게 원심분리한 후 사용합니다*.

*시약을 혼합하지 않거나, 혼합을 위해 진동기를 사용하거나, 얼음 위에 시약을 배치하지 않으면 반응 성능이 저하될 수 있습니다.

2) 세포 유형**에 따라 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 5000rpm에서 2분간 원심분리하여 세포를 수집하고 배지 웰을 흡입합니다. 세포를 96웰 플레이트에서 배양하는 경우 배지를 직접 흡입할 수 있습니다.

3) 각 웰에 FCD 세척 완충액 150 μL를 첨가하고, 세포를 불어서 세척한 후, 5000 rpm에서 2분간 원심분리하고, FCD 세척 완충액을 흡입합니다***.

​​​​​​4) 각 well에 FCD Lysis Buffer Solution 48 μL와 DNase Ⅰ Solution 2 μL를 넣고, 실온에서 블로우 및 혼합한 후, 5분간 방치한 후, 배양**** 후 FCD Stop Solution 2.5 μL를 넣고, 약 5회 블로우 및 혼합하여 절단산물을 얻는다*****.

** 세포 수에 대한 기본 요구 사항은 웰당 1 × 10 ⁴ 세포이며, 본 키트는 1 × 10 ³ - 1 × 10 ⁶ 세포 범위에서 사용할 수 있습니다. 세포 수가 더 많을 경우 FCD Lysis Buffer 용액과 DNaseⅠ 용액의 양을 적절하게 비례하여 늘릴 수 있습니다.

*** 원심분리 조건은 세포마다 다르므로 사용하는 세포에 적합한 속도로 원심분리하시기 바랍니다.

**** 용해물 50 μL에 FCD 정지 용액 2.5 μL를 첨가하고 필요에 따라 FCD 정지 용액의 양을 늘리세요.

***** 세포 용해 산물 용액을 장기간 보관하려면 -20°C에 보관하세요.

5) 4 x Hifair™ FCD RT Mix를 실온에서 녹이고 약간 역전시켜 섞은 후 얼음 위에 두고 아래 표에 따라 반응 시스템을 구성합니다.

*******권장 사용 수준은 2-5 μL이며, 45%를 초과하지 않도록 하십시오.

1. 역전사

위에서 준비한 반응 용액을 피펫으로 섞어 가볍게 섞은 후, 아래 표의 절차에 따라 역전사 반응을 실시한다.

* 권장 역전사 온도는 55°C입니다. 높은 GC 함량 템플릿 또는 복합 템플릿의 경우 역전사 온도를 60°C로 높일 수 있습니다. 역전사 생성물은 하류 RT-qPCR 검출에 직접 사용할 수 있습니다. 역전사 시스템에 의한 qPCR 반응의 억제를 피하고 적절한 Ct 값(10-35)을 얻기 위해 생성물을 10-1000배 희석한 다음 사용할 수 있습니다. 하류 실험을 잠시 수행하지 않는 경우 보관을 위해 -20℃에 둘 수 있습니다.

1. 형광 정량 PCR

1) 반응 체계 구성

반응 용액을 조제할 때(얼음 위에서 조제할 때) 다음 비율을 권장합니다.

* 역전사 생성물의 RT-qPCR 부피의 1/10 이상을 첨가하지 마십시오. 고농도의 템플릿은 비특이적 증폭으로 쉽게 이어질 수 있으므로 5-50배로 적절히 희석하십시오. 권장되는 템플릿 양은 4 μL이며 6 μL를 초과하지 않도록 하십시오. 반응 성능이 좋지 않으면 프라이머 농도를 0.2-1.0 μmol/L 범위로 조정할 수 있습니다.

2) 형광 정량 PCR 증폭 절차(2단계 방법)

3) 형광 정량 PCR을 위한 급속 증폭 과정 (2단계 방법)

* 어닐링/연장 온도와 최종 연장 시간은 실험 요구 사항에 따라 적절히 조정할 수 있습니다. 빠른 프로그램은 대부분의 유전자에 적합하며 표준 프로그램은 개별 복합 2차 구조 유전자에 대해 시도할 수 있습니다.

노트

1. 이 제품은 연구 목적으로만 사용됩니다.
2. 안전을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용해 주시기 바랍니다.

버전 EN20230908

서류:

매뉴얼

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf