Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit(컬럼 기반)는 DNA 샘플의 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 빠르게 전환하는 반면, 메틸화된 시토신은 그대로 둡니다. 고온의 비설파이트 처리 중에 이중 가닥 DNA는 단일 가닥으로 변성됩니다. HSO3-가 존재할 경우, 시토신 잔류물은 탈아민화되어 우라실로 전환되고, 메틸화된 시토신은 그대로 유지됩니다. 이후의 PCR 증폭에서 우라실은 티민(T)으로 대체됩니다. 변환 과정은 단 5분이 소요되며, 100 pg에서 2 μg까지의 DNA 입력을 수용하고 메틸화되지 않은 시토신에 대해 ≥99%의 변환 효율을 달성합니다. 변환된 DNA는 PCR 증폭 및 NGS 시퀀싱과 같은 다운스트림 애플리케이션에 적합합니다.

특징

낮은 입력: 100 pg에서 2 μg까지의 샘플 변환에 적합

짧은 변환 시간: 약 5분.

최소 샘플 손상: 변환 후에도 좋은 샘플 무결성을 유지합니다.

높은 전환 효율성: 전환율 ≥99%, 높은 GC 영역에서 높은 전환율과 낮은 거짓 양성률을 보입니다.

단일 세포 DNA 메틸화 전환과 같은 희귀 샘플에 적합합니다 .

RNA 샘플의 메틸화 변환이 가능합니다.

제품 구성 요소

메모:

상자당 10회 테스트하는 경우: 세척 용액에 무수 에탄올 4.4mL을 첨가합니다.

상자당 50회 테스트의 경우: 세척 용액에 무수 에탄올 22mL을 첨가합니다.

무수 에탄올을 넣은 후, 뒤집어서 잘 섞은 다음, 나중에 사용하기 위해 보관합니다. 에탄올 증발을 방지하기 위해 병 뚜껑을 단단히 닫아야 합니다. 에탄올 증발은 시약 성능에 영향을 미칠 수 있습니다.

수치

그림 4. 인간 게놈 DNA 샘플에 대한 비설파이트 전환은 12225와 경쟁사 Q 전환 키트를 모두 사용하여 수행되었습니다. 이후, 메틸화 특정 단일 가닥 DNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 라이브러리를 생성했습니다. 라이브러리 수율과 품질 관리 데이터는 위에 제시되어 있습니다. 결과는 12225와 경쟁사 Q 키트 모두에서 풀링된 라이브러리를 시퀀싱할 때 12225 키트가 더 높은 데이터 출력을 생성하고, 더 높은 온타겟 비율(%)을 달성했으며, 더 낮은 복제율(%)을 보였다는 것을 보여줍니다.

배송 및 보관

12225-A 변환 용액은 실온에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다. 다른 구성 요소는 실온에서 보관합니다. 유통기한은 12개월입니다.

메모:

1. 다운스트림 실험의 성공을 보장하기 위해 변환 단계에서 입력 DNA의 총량을 정확하게 정량화합니다. DNA 정량화를 위해 Qubit 3.0/4.0을 사용하는 것이 좋으며, A260/A280 비율은 1.7~1.9 사이입니다. 입력 DNA 범위는 100 pg~2 μg 사이여야 하며, 최적 범위는 100 ng~1 μg입니다. DNA 입력이 부족하면 다운스트림 검출이 방해받을 수 있고, 입력이 너무 많으면 회수 및 변환 효율이 떨어질 수 있습니다.

2. 전환액, 탈황화액, 세척액에는 휘발성 성분이 포함되어 있습니다. 사용 후 즉시 캡을 조여 실온에서 보관하십시오.

3. 변환 후 샘플의 경우, 즉시 하류 실험을 진행하십시오. 단기 보관의 경우 -20°C에서 보관하고, 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관하십시오.

4. 안전과 건강을 위해 작업 중에는 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용하세요.

5. 이 제품은 연구용으로만 사용하세요!

지침

시약 및 소모품 준비: 1.5 mL 멸균 원심분리관, 효소가 없는 물, 무수 에탄올, PCR 튜브

l 중아황산염 전환:

1) 검사할 샘플 수에 따라 해당 멸균 PCR 튜브를 준비하고, 아래 표에 따라 반응 시스템을 준비합니다.

2) 변환 시스템

피펫을 이용하여 위의 시스템을 불어 섞거나, 볼텍스하여 5초간 섞은 후, 잠시 원심분리하여 반응액을 PCR 튜브 바닥에 버립니다.

v 참고: 1. 이때 PCR 튜브에 있는 반응 용액의 총 부피는 200 μL입니다. 형질 전환을 보다 완전하게 하기 위해 반응 용액을 동일한 부분으로 나누어 2) 단계에서 불어넣고 섞은 후 새로운 멸균 PCR 튜브로 옮겨 형질 전환 절차를 실행해야 합니다. 전환 후 두 PCR 튜브의 반응 용액을 동일한 정제 컬럼에 합쳐 정제했습니다.

2. 샘플 용량이 20~40 μL인 경우, 변환 용액의 용량을 줄여 총 용량을 200 μL로 유지합니다.

3. 샘플량이 50 μL일 경우, 형질전환 용액을 150 μL 첨가하여 전체량을 200 μL로 유지하고 형질전환 시간을 6~10분으로 연장한다.

3) CT 변환 프로그램 설정

PCR 튜브를 반응을 수행하기 위한 사전 설정된 프로그램이 있는 PCR 장비에 놓습니다.

l 정화

1) 변환 용액 200 μL를 정제컬럼에 옮기고 30 ~ 60 초간 13000 g로 원심분리한 후 여과 액을 버리고 정제컬럼을 다시 수집 튜브 에 넣는다.

2) 세척 완충액 100 μL를 정제 컬럼 에 첨가하고 (절대 에탄올이 첨가되었는지 확인), 30-60초 동안 13000 g 로 원심분리하고 , 여과액을 버리고 정제 컬럼을 수집 튜브에 넣 습니다 . 다시;

3) 정제 컬럼 에 200 μL의 탈황화 완충액을 넣고 , 반응물을 실온에서 20분간 방치한다. 반응 후, 30-60초 동안 13000 g 로 원심분리하고 , 여과액을 버리고, 정제 컬럼을 다시 수집 튜브 에 넣는다.

4) 세척 완충액 200 μL를 정제 컬럼 에 넣고 30~60초 동안 원심분리합니다. 13000 g에서 여과액을 버리고 정제 컬럼 을 수집 튜브 에 다시 넣 습니다.

5) 4) 단계를 한 번 반복합니다.

6) 정제컬럼을 준비된 1.5ml 원심분리관에 옮긴 후 , 필터막 덮개를 열고 건조한 후 10~30μL의 용출완충액을 필터막 중앙에 첨가하고, 실온에서 1분간 방치한 후 13000g에서 1분간 원심분리하여 DNA 를 수집한다 .

7) DNA를 일시적으로 -20℃에 보관하십시오. 장기 보관의 경우 DNA를 -80℃에 보관하고 불필요한 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.

참고사항: 정제된 형질전환 산물은 후속 PCR 반응이나 시퀀싱 과정에 직접 사용할 수 있습니다.

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