Hieff NGS® DNA&RNA 라이브러리 공동 준비 키트 V2는 효율적인 cDNA 합성 시약과 효소 소화 시약을 포함하는 Illumina®&MGI® 시퀀싱 플랫폼을 위한 DNA&RNA 공동 라이브러리 키트입니다. 기존의 라이브러리 구축 방법과 비교했을 때, 이 제품은 효율적으로 cDNA 합성과 DNA&RNA 라이브러리를 완료할 수 있습니다. 하나의 튜브로 구성이 가능합니다. 키트에는 DNA 단편화를 위한 고품질 효소가 포함되어 있으며, DNA 단편화, 말단 복구, dA-테일링을 하나의 단계로 결합하여 라이브러리 준비에 드는 시간과 비용을 크게 줄여줍니다. 이 라이브러리 준비 키트는 뛰어난 라이브러리 변환율을 가지고 있으며 모든 일반적인 동물, 식물, 미생물 등의 샘플과 FFPE 샘플에 적용할 수 있습니다. 최신 최적화된 리가제를 사용하는 이 업그레이드된 키트는 어댑터 결찰 중 자가 결찰율을 크게 낮춥니다. 게다가 새로운 고충실도 중합효소를 도입하여 증폭의 동질성과 충실도를 더욱 개선합니다.

키트에 제공된 모든 구성 요소는 엄격한 품질 관리와 기능 검증을 거쳤으며, 이를 통해 라이브러리 구축의 안정성과 반복성이 최대한 보장됩니다.

명세서

구성 요소

참고: *는 이 시약이 이 키트에 포함되어 있지 않으며 추가 시약이 필요하다는 것을 나타냅니다. Illumina ^® 및 MGI ^® 의 듀얼 플랫폼과 호환되지만 추가 프라이머 혼합물(MGI ^® 용 CAT # 13334 프라이머 혼합물 및 Illumina ^® 용 CAT # 13335 프라이머 혼합물)이 필요합니다.

작업 흐름:

저장

본 제품은 -25~-15℃에서 보관하시기 바랍니다. 1년.

노트

작업에 대하여

1. 1. 안전을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용하고 작업해 주세요.
2. 구성품을 실온에서 해동합니다. 해동 후, 흔들어서 완전히 섞은 다음, 튜브를 잠깐 돌린 후 얼음에 넣어 나중에 사용합니다.
3. 각 반응 단계는 가열된 뚜껑이 있는 열 순환기에서 수행하는 것이 좋습니다. 열 순환기는 사용하기 전에 설정 온도로 예열해야 합니다.
4. RNase가 없는 소모품을 사용하세요 오염 및 실험 구역 정기 청소. ThermoFisher의 RNAZap ^TM 고효율 핵산 제거 스프레이를 RNase 오염을 제거하는 데 권장했습니다.
5. 부적절한 조작은 에어로졸 오염을 일으킬 가능성이 매우 높으며, 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. PCR 반응 혼합 영역과 PCR 생성물 정제 검정 영역의 의무적인 물리적 격리가 권장됩니다. 라이브러리 구축을 위한 특수 피펫과 같은 장비가 장착되어 있습니다.
6. 6. 본 제품은 연구용으로만 사용됩니다.

어댑터 결찰

1. 고객은 실험 요구 사항에 따라 Illumina 또는 MGI 긴 어댑터(바코드 어댑터) 키트와 짧은 어댑터 키트를 선택할 수 있습니다.
2. 고품질의 상용 어댑터를 선택하는 것이 좋습니다. 자체 제작 어댑터를 선택하는 경우 NGS 프라이머 합성 경험이 있는 회사에 맡기고 엄격한 오염 관리가 필요하다는 점을 언급하세요. 또한 교차 오염을 방지하기 위해 클린 벤치에서 DNA 어닐링 용액을 준비하고 매번 한 가지 유형의 어댑터만 작동하는 것이 좋습니다.
3. 어댑터는 얼음 위나 4°C에서 해동하세요. 실온에서 작동할 경우, 어댑터 변성을 방지하기 위해 실험실 온도는 25°C를 초과하지 않아야 합니다.
4. 어댑터의 농도는 라이게이션 효율과 라이브러리 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 키트에 추가된 어댑터 볼륨은 5 μl로 고정됩니다. 어댑터는 0.1×TE 버퍼로 희석하는 것이 좋으며 희석된 어댑터는 4°C에서 48시간 동안 보관할 수 있습니다. 표 1은 다양한 양의 입력 RNA에 대한 권장 어댑터 양을 나열합니다.

표 1-1 다양한 입력에 대한 권장 ^Illumina® 어댑터 수량 DNA와 RNA

표 1-2 다양한 입력에 대한 권장 ^MGI® 어댑터 수량 DNA와 RNA

*어댑터 사용은 Total RNA 샘플의 종류와 입력량에 따라 조절될 수 있습니다.

도서관 증폭

증폭 사이클 수는 엄격하게 제어해야 합니다. 증폭이 충분하지 않으면 라이브러리 수율이 낮아질 수 있습니다. 과증폭은 편향, 오류, 중복된 판독 및 키메라 생성물을 증가시킬 수 있습니다. 표 2 목록은 1μg의 라이브러리 수율을 목표로 하는 권장 사이클 번호를 나열합니다.

테이블 2 DNA&RNA 라이브러리 생성을 위해 권장되는 사이클 수 *

주: *라이브러리의 수율은 입력량과 증폭 사이클 수에만 관련되는 것이 아니라 샘플의 품질, 단편화 조건 및 분류 조건의 영향을 받습니다. 라이브러리 구축 과정에서 실제 상황에 따라 가장 적합한 조건을 선택하십시오.

비드 기반 DNA 정화 및 크기 선택

1. 1. 라이브러리 구축 과정에는 DNA 정제 자기 비드가 필요한 여러 단계가 있습니다. DNA 정제 및 크기 선택을 위해 Hieff NGS™ DNA 선택 비드(Yeasen Cat#12601) 또는 AMPure® XP 자기 비드(Beckman Cat#A63880)를 권장합니다.
2. 2. 자기 비드는 사용 전 실온에서 평형을 이루어야 합니다. 그렇지 않으면 수율이 감소하고 크기 선택 효과에 영향을 미칩니다.
3. 3. 자석 비드는 사용 전에 소용돌이 치거나 피펫으로 잘 섞어야 합니다.
4. 4. 상층액을 옮길 때 비즈를 흡입하지 마십시오. 비즈가 미량이라도 다음 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.
5. 5. 80% 에탄올은 신선하게 제조해야 합니다. 그렇지 않으면 회수 효율에 영향을 미칩니다.
6. 6. 제품을 용출하기 전에 자석 비드를 실온에서 건조해야 합니다. 건조가 충분하지 않으면 에탄올 잔류물이 후속 반응에 영향을 미치기 쉽고, 건조가 너무 심하면 자석 비드가 갈라지고 정제 수율이 감소합니다. 일반적으로 실온에서 3~5분 동안 건조하면 비드를 완전히 건조하기에 충분합니다.
7. 7. 필요한 경우 정제되거나 크기가 선택된 DNA 샘플은 용출됩니다. 1× TE 완충액은 4°C에서 1~2주 동안 보관하거나 -20°C에서 한 달 동안 보관할 수 있습니다.

도서관 품질 분석

1. 구축된 라이브러리의 품질은 일반적으로 농도와 크기 분포를 측정하여 분석됩니다.
2. 라이브러리의 농도는 Qubit, PicoGreen이나 qPCR과 같은 형광 기반 방법을 통해 측정할 수 있습니다.
3. NanoDrop과 같은 흡광도 기반 정량화 방법을 사용하는 것은 권장되지 않습니다.
4. 라이브러리 정량화에는 qPCR 방법을 사용하는 것이 좋습니다. Qubit 및 PicoGreen과 같은 형광 기반 방법은 불완전한 dsDNA 구조(어댑터가 없거나 어댑터로 연결된 끝 중 하나만 있는 삽입물)와 완전한 라이브러리를 구별할 수 없습니다. qPCR 방법은 어댑터로 양쪽 끝이 연결된 완전한 라이브러리(시퀀싱 가능한 라이브러리)만 증폭하고 측정하므로 로딩을 위한 보다 정확한 측정을 제공합니다.
5. 라이브러리의 크기 분포는 Agilent Bioanalyzer나 모세관 전기영동 또는 미세유체역학의 원리를 기반으로 하는 다른 장치를 사용하여 분석할 수 있습니다.

기타 자료

1. 1. DNA 정제 자석 비드: Hieff NGS™ DNA 선택 비드(Yeasen Cat#12601) 또는 AMPure ^® XP 비드(A63880) 또는 이와 동등한 다른 제품.

2. 어댑터: Illumina용 완전한 어댑터(Yeasen Cat#13519-13520 또는 기타 동등한 제품) 또는 MGI용 완전한 어댑터(Yeasen Cat#13360-13362 또는 기타 동등한 제품).

3. 라이브러리 품질 분석: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip 또는 이와 동등한 제품, 라이브러리 정량 시약.
4. 기타 재료: 무수 에탄올, 멸균 초순수, 저잔류 피펫 팁, PCR 튜브, 자석 스탠드, 열 순환기 등.

서류:

매뉴얼

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA 라이브러리 공동 준비 키트 V2.pdf