제품 설명

Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit은 RNA 단편화 시약, 역전사 시약, 기존 및 스트랜드 특정 ds-cDNA 합성 시약, 라이브러리 증폭 시약을 포함한 Illumina® 및 MGI® 시퀀싱 플랫폼을 위한 총 RNA 시퀀싱 라이브러리 구축 키트입니다. 시퀀싱 라이브러리는 mRNA 정제 키트 또는 rRNA 제거 키트에 이어 구축할 수 있습니다. 2스트랜드 합성 모듈에는 기존 라이브러리 또는 스트랜드 특정 라이브러리에 대한 필요성을 충족시키기 위해 2개의 버퍼가 장착되어 있습니다. 그 중 스트랜드 특정 2스트랜드 합성 버퍼에서 dTTP를 dUTP로 대체하여 dUTP를 두 번째 cDNA 스트랜드에 추가할 수 있습니다. 이 키트에 사용된 고성능 DNA 중합효소는 우라실이 포함된 DNA 템플릿을 증폭시킬 수 없어 스트랜드 특이성을 달성합니다. 제공된 모든 시약은 엄격한 품질 관리 및 기능 검증을 거쳤으며, 라이브러리 구축의 안정성과 재현성을 최대한 보장합니다.

작업 흐름

제품 구성 요소

참고: 이 키트는 Illumina와 MGI 플랫폼 모두와 호환되지만, 추가 Illumina 또는 MGI 프라이머 믹스(Illumina용 Cat# 13335 프라이머 믹스, MGI용 Cat# 13334 프라이머 믹스)가 필요합니다.

배송 및 보관

상자 I에 들어 있는 Hieff NGS™ Ultima 듀얼모드 mRNA 라이브러리 준비 키트 구성품은 얼음팩과 함께 배송되며 2~8°C에서 1년 동안 보관할 수 있습니다.
Hieff NGS™ Ultima 듀얼모드 mRNA 라이브러리 준비 키트의 상자 II 구성품은 건조 얼음과 함께 배송되며 -20°C에서 1년 동안 보관할 수 있습니다.

주의사항

1 작업
1.1 귀하의 안전과 건강을 위해, 이 제품을 사용할 때는 실험실 코트와 일회용 장갑과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 이 제품은 연구용으로만 사용할 수 있습니다!
1.2 실온에서 성분을 해동합니다. 위아래로 여러 번 뒤집어서 완전히 섞은 다음, 잠시 회전을 멈추고 얼음 위에 두어 사용합니다.
1.3 각 단계 반응은 가열된 뚜껑이 있는 열 순환기에서 수행하는 것이 좋습니다. 열 순환기는 사용하기 전에 설정 온도로 예열해야 합니다.
1.4 RNase 오염이 없는 용품을 사용하고, 실험 공간을 정기적으로 청소하는 것이 필요합니다.
1.5 부적절한 조작은 에어로졸 오염을 일으킬 가능성이 매우 높으며, 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. PCR 반응 혼합 영역과 PCR 생성물 정제 검정 영역의 의무적인 물리적 격리가 권장됩니다. 라이브러리 구축을 위한 특수 피펫과 같은 장비가 장착되어 있습니다.
2 어댑터 결찰
2.1 Illumina 또는 MGI 긴 어댑터(바코드 어댑터) 키트와 짧은 어댑터 키트는 고객이 실험 요구 사항에 따라 선택할 수 있도록 제공됩니다.
2.2 고품질의 상용 어댑터를 선택하는 것이 좋습니다. 자체 제작 어댑터를 선택하는 경우 NGS 프라이머 합성 경험이 있는 회사에 맡기고 엄격한 오염 관리의 필요성에 대해 언급하세요. 또한 교차 오염을 방지하기 위해 클린 벤치에서 DNA 어닐링 용액을 준비하고 매번 한 가지 유형의 어댑터만 작동하는 것이 좋습니다.
2.3 어댑터는 얼음 위나 4°C에서 해동하세요. 실온에서 작동할 경우 어댑터 변성을 방지하기 위해 실험실 온도는 25°C를 초과하지 않아야 합니다.
2.4 어댑터의 농도는 라이게이션 효율과 라이브러리 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 키트에 추가된 어댑터 용량은 5 μl로 고정되어 있습니다. 어댑터는 0.1×TE 완충액으로 희석하는 것이 좋으며 희석된 어댑터는 4°C에서 48시간 동안 보관할 수 있습니다. 표 1에는 다양한 양의 입력 RNA에 대한 권장 어댑터 양이 나와 있습니다.

표 1-1 다양한 입력 RNA에 대한 권장 Illumina 어댑터 양

표 1-2 다양한 입력 RNA에 대한 권장 MGI® 어댑터 양

*어댑터 사용은 Total RNA 샘플의 종류와 입력량에 따라 조절될 수 있습니다.

3 라이브러리 증폭

3.1 1세대 DNA 중합효소를 기반으로, 키트에 포함된 고성능 DNA 중합효소는 증폭 균일성이 크게 향상되었으며 증폭 편향이 나타나지 않습니다.
3.2 인덱스 어댑터(긴 어댑터 또는 대형 Y 어댑터라고도 함)가 타겟 DNA에 연결된 경우, 본 키트에 제공된 프라이머 믹스를 사용하여 증폭할 수 있습니다. DNA 연결에 "짧은 어댑터" 또는 "작은 Y 어댑터"를 사용하는 경우, 증폭을 위해 인덱스 프라이머가 필요합니다.
3.3 증폭 사이클 수는 엄격하게 제어해야 합니다. 증폭이 충분하지 않으면 라이브러리 수율이 낮아질 수 있습니다. 과증폭은 편향, 오류, 중복된 읽기, 키메라 생성물 및 확장 돌연변이 축적을 증가시킬 수 있습니다. 표 2는 PCR 증폭에 권장되는 사이클 수를 나열합니다.

표 2 RNA 라이브러리 생성을 위한 권장 사이클 수*

참고:*라이브러리의 수율은 입력량과 증폭 사이클 수에만 관련되는 것이 아니라 샘플의 품질, 단편화 조건 및 분류 조건에도 영향을 받습니다. 라이브러리 구축 과정에서 실제 상황에 따라 가장 적합한 조건을 선택하십시오.

4 비드 기반 DNA 클린업 및 크기 선택

4.1 라이브러리 구축 과정에는 DNA 정제 자기 비드가 필요한 여러 단계가 있습니다. DNA 정제 및 크기 선택을 위해 Hieff NGS™ DNA 선택 비드(Yeasen Cat#12601) 또는 AMPure® XP 자기 비드(Beckman Cat#A63880)를 권장합니다.
4.2 자기 비드는 사용 전 실온에서 평형을 이루어야 합니다. 그렇지 않으면 수율이 감소하고 크기 선택 효과에 영향을 미칩니다.
4.3 자석 비드는 사용 전에 진동이나 피펫팅을 통해 잘 섞어야 합니다.
4.4 상층액을 옮길 때 비드를 흡입하지 마십시오. 미량의 비드라도 다음 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.
4.5 80% 에탄올은 신선하게 제조해야 합니다. 그렇지 않으면 회수 효율에 영향을 미칩니다.
4.6 자석 비드는 제품을 용출하기 전에 실온에서 건조해야 합니다. 건조가 충분하지 않으면 에탄올 잔류물이 후속 반응에 영향을 미치기 쉽고, 건조가 너무 심하면 자석 비드가 갈라지고 정제 수율이 감소합니다. 일반적으로 실온에서 3~5분 동안 건조하면 비드가 완전히 건조되기에 충분합니다.
4.7 필요한 경우, TE 완충액에서 용출된 정제된 DNA 샘플 또는 크기가 선택된 DNA 샘플은 4°C에서 1~2주 동안 또는 -20°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
5. 도서관 품질 분석
5.1 일반적으로 구축된 라이브러리의 품질은 길이 분포와 농도 검출을 통해 평가할 수 있습니다.
5.2 라이브러리 농도 검출: Qubit®, PicoGreen® 등과 같은 이중 가닥 DNA 형광 염료를 기반으로 한 방법; qPCR을 기반으로 한 절대 정량.
5.3 NanoDrop® 등의 스펙트럼 검출 기반 방법은 라이브러리 농도 검출에 적용할 수 없습니다.
5.4 qPCR은 라이브러리 농도 검출에 권장됩니다. Qubit®, PicoGreen® 및 이중 가닥 DNA 형광 염료를 기반으로 하는 다른 방법을 통해 한쪽 끝에서 어댑터에 연결된 제품, 양쪽 끝에서 어댑터에 연결되지 않은 제품 및 기타 불완전한 이중 가닥 제품을 효과적으로 구별할 수 없습니다. qPCR의 절대 정량화는 PCR 증폭의 원리에 기반하며, 이는 샘플 양쪽 끝에서 어댑터의 완전한 라이브러리(시퀀싱할 수 있는 라이브러리)만 정량화하며, 단일 끝 또는 이중 끝에서 어댑터에 연결되지 않은 비시퀀싱 라이브러리의 간섭은 제외합니다.
5.5 라이브러리 길이 분포 검출은 Agilent Bioanalyzer 2100 및 모세관 전기영동이나 미세유체역학의 원리를 기반으로 하는 기타 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다.

서류:

안전 데이터 시트

12308-구성요소 A-MSDS-HB22803.pdf

12308-구성요소 B-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성요소 C-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성요소 D-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성품 E-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성 요소 F-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성요소 G-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성품 H-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성요소 I-MSDS-HB220803.pdf

12308-구성품 K-MSDS-HB220803.pdf

매뉴얼

12308ES-Hieff NGS™ Ultima 듀얼모드 RNA 라이브러리 준비 키트-버전 EN20230327.pdf

인용 및 참조:

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T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - 암 면역학 연구, 2023 IF: 12.0

[10] 간세포암에서 시스플라틴 저항성 극복을 위한 이중 표적 생체모방 나노 전달 시스템을 기반으로 한 복합 치료
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[11] PIAS3는 TGF-β 신호전달 경로를 통해 TXNIP를 조절하여 간세포암에서 페로프토시스를 촉진합니다.
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - 약리학 연구, 2023 IF:9.3

[12] Saccharomyces cerevisiae에서 HyperTRIBE를 이용한 RNA 결합 단백질 표적 식별
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[13] 미생물군은 해파리의 생명주기 전환과 선충세포 역학을 조절합니다.
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[14] 전사체와 miRNA 프로필은 "84K" 포플러의 2차 목재부 형성의 조절 네트워크와 주요 조절자를 보여줍니다.
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - 국제 분자 과학 저널, 2023 IF:5.6