Hieff NGS ^TM EvoMax RNA Library Prep Kit(dUTP)는 Illumina 및 MGI 플랫폼과 호환되는 사전 혼합된 액티노마이신 D 무함유 및 스트랜드 특이적 총 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비 키트입니다. 이 제품은 튜브 또는 밀봉 키트의 두 가지 유형으로 제공되며, 이 키트는 자동 액체 처리 장치 또는 수동 조작을 통해 더욱 편리합니다. 이 키트에는 RNA 단편화 시약, 역전사 시약, 스트랜드 특이적 ds-cDNA 합성 시약 및 라이브러리 증폭 시약이 포함되어 있습니다. mRNA 정제 키트 또는 rRNA 제거 키트와 연결하여 mRNA 또는 lncRNA 연구를 수행할 수 있습니다. 이 제품은 액티노마이신 D가 없는 고쇄 특이성 라이브러리를 얻기 위해 역전사 모듈을 최적화하여 실험자의 안전을 더욱 보장합니다. 모든 시약은 라이브러리 준비의 안정성과 반복성을 극대화하기 위해 엄격한 품질 관리 및 기능 검증을 거쳤습니다.

명세서

구성 요소

참고: * 표기는 해당 구성 요소가 키트에 포함되지 않음을 나타냅니다. 완전한 어댑터를 사용하는 경우 프라이머 믹스가 필요하지만, 그렇지 않은 경우에는 필요하지 않습니다 . 이 키트는 Illumina 및 MGI 플랫폼과 호환되지만 완전한 어댑터를 사용하는 경우 Illumina® 또는 MGI 플랫폼에 추가 프라이머 믹스(MGI ^TM 용 Cat # 13334 프라이머 믹스 및 Illumina®용 Cat # 13335 프라이머 믹스)가 필요합니다.

수치

플레이트 시약 그룹의 레이아웃.

그림 1: 밀봉 플레이트 라이브러리 키트의 시약 레이아웃

그림 2. EvoMax RNA Library Prep Kit의 단순화된 구성 요소.

저장

본 제품은 -25~-15℃에서 1년간 보관하시기 바랍니다.

지침

1. 20 μL 시스템에 첨가하는 권장량은 0.1-1 단위(U)이며, 실제 결과에 따라 투입량을 조절할 수 있습니다.

2. 실험의 요구에 따라 dUTP의 최종 농도는 0.2~0.6 mM 사이로 조절 가능하며, 0.2 mM dTTP를 선택적으로 첨가할 수 있습니다.

3. 25~37℃에서의 반응시간은 실험적 요구에 따라 5~10분 이내로 조절 가능합니다.

노트

1. 운영

1) 안전을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑 을 착용하고 작업해 주시기 바랍니다.

2) 실온에서 성분을 해동합니다. 위아래로 여러 번 뒤집어서 완전히 섞은 다음, 잠시 회전을 멈추고 얼음 위에 두어 사용합니다.

3) 각 단계 반응은 가열된 뚜껑이 있는 열 순환기에서 수행하는 것이 좋습니다. 열 순환기는 사용하기 전에 설정 온도로 예열해야 합니다.

4) RNase 오염이 없는 공급품과 실험 구역을 정기적으로 청소하는 것이 필요합니다. ThermoFisher의 RNAZap ^TM 고효율 핵산 제거 스프레이를 사용하여 RNase 오염을 제거하는 것이 좋습니다.

5) 부적절한 조작은 에어로졸 오염을 일으킬 가능성이 매우 높으며, 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. PCR 반응 혼합 영역과 PCR 생성물 정제 검정 영역의 의무적인 물리적 격리가 권장됩니다. 라이브러리 구축을 위한 특수 피펫과 같은 장비가 장착되어 있습니다.

6) 이 시약은 일회용입니다. 여러 번 사용하는 것은 엄격히 금지되어 있습니다.

7) 본 제품은 연구용으로만 사용됩니다.

2. 어댑터 결찰

1) Illumina 또는 MGI 긴 어댑터(바코드 어댑터) 키트와 짧은 어댑터 키트는 고객이 실험 요구 사항에 따라 선택할 수 있도록 제공됩니다.

2) 고품질의 상용 어댑터를 선택하는 것이 좋습니다. 자체 제작 어댑터를 선택하는 경우 NGS 프라이머 합성 경험이 있는 회사에 맡기고 엄격한 오염 관리가 필요하다는 점을 언급하세요. 또한 교차 오염을 방지하기 위해 클린 벤치에서 DNA 어닐링 용액을 준비하고 매번 한 가지 유형의 어댑터만 작동하는 것이 좋습니다.

3) 어댑터는 얼음 위나 4°C에서 해동하세요. 실온에서 작동할 경우, 어댑터 변성을 방지하기 위해 실험실 온도는 25°C를 초과하지 않아야 합니다.

4) 어댑터의 농도는 라이게이션 효율과 라이브러리 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 키트에 추가된 어댑터 용량은 5 μl로 고정되어 있습니다. 어댑터는 0.1×TE 완충액으로 희석하는 것이 좋으며 희석된 어댑터는 4°C에서 48시간 동안 보관할 수 있습니다. 표 1은 다양한 양의 입력 RNA에 대한 권장 어댑터 양을 나열합니다.

표 1-1 다양한 입력 RNA에 대한 권장 Illumina 어댑터 양

표 1-2 다양한 입력 RNA에 대한 권장 MGI 어댑터 양

* 어댑터 사용은 total RNA 샘플 종류 및 입력량에 따라 조절 가능

3. 라이브러리 증폭

1) 1세대 DNA 중합효소를 기반으로, 키트에 포함된 고성능 DNA 중합효소는 증폭 균일성이 크게 향상되었으며 증폭 편향이 나타나지 않습니다.

2) 증폭 사이클 수는 엄격하게 제어해야 합니다. 증폭이 충분하지 않으면 라이브러리 수율이 낮아질 수 있습니다. 과증폭은 편향, 오류, 중복된 읽기, 키메라 생성물 및 확장 돌연변이 축적을 증가시킬 수 있습니다. 표 2는 PCR 증폭에 권장되는 사이클 수를 나열합니다.

3) 표 2에서 권장하는 권장 사이클 수는 대부분의 라이브러리 준비 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 샘플의 품질이 좋지 않은 경우(예: 심각하게 저하된 FFPE 샘플) 실제 상황에 따라 사이클 수를 적절히 늘릴 수 있습니다. mRNA는 종과 조직에 따라 다르므로 증폭 사이클 수를 조정해야 한다는 점에 유의하세요.

표 2 입력 총 RNA 볼륨 및 권장 증폭 주기 표 *

[참고]: *라이브러리의 수율은 입력량과 증폭 사이클 수에만 관련되는 것이 아니라 샘플의 품질, 단편화 조건 및 분류 조건의 영향을 받습니다. 라이브러리 구축 과정에서 실제 상황에 따라 가장 적합한 조건을 선택하십시오.

4. 비드 기반 DNA 정화 및 크기 선택

1) 라이브러리 구축 프로세스에는 DNA 정제 자기 비드가 필요한 여러 단계가 있습니다. DNA 정제 및 크기 선택을 위해 Hieff NGS™ DNA 선택 비드(Yeasen Cat#12601) 또는 AMPure® XP 자기 비드(Beckman Cat#A63880)를 권장합니다.

2) 자기 비드는 사용 전에 실온으로 맞춰야 합니다. 그렇지 않으면 수율이 감소하고 크기 선택 효과가 영향을 받습니다.

3) 자석 비드는 사용 전에 진동이나 피펫팅을 통해 잘 섞어야 합니다.

4) 상층액을 옮길 때 비드를 흡입하지 마십시오. 비드가 미량이라도 다음 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.

5) 80% 에탄올은 신선하게 제조해야 합니다. 그렇지 않으면 회수 효율에 영향을 미칩니다.

6) 자석 비드는 제품을 용출하기 전에 실온에서 건조해야 합니다. 건조가 충분하지 않으면 에탄올 잔류물이 후속 반응에 영향을 미치기 쉽고, 건조가 너무 심하면 자석 비드가 갈라지고 정제 수율이 감소합니다. 일반적으로 실온에서 3~5분 동안 건조하면 비드가 완전히 건조되기에 충분합니다.

7) 필요한 경우, TE 완충액에서 용출된 정제된 DNA 샘플 또는 크기가 선택된 DNA 샘플은 4°C에서 1~2주 동안 또는 -20°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

5. 도서관 품질 분석

일반적으로, 구축된 라이브러리의 품질은 농도 검출과 길이 분포 검출을 통해 평가할 수 있습니다.

6. 기타 자료

1) mRNA 농축 키트: Hieff NGS® mRNA 분리 마스터 키트 V2(Yeasen Cat # 12629).

2) rRNA 제거 키트: Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS) (Yeasen Cat # 12257) 또는 기타 rRNA 제거 키트.

3) 자기 비드의 RNA 정제: Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat # 12602) 또는 이와 동등한 다른 제품.

4) DNA 정제 자기 비드: Hieff NGS® DNA 선택 비드(Yeasen Cat # 12601) 또는 AMPure® XP 비드(A63880) 또는 이와 동등한 다른 제품.

5) RNA 품질 관리: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip 또는 이와 동등한 제품.

6) 어댑터: Illumina® 사용을 위한 완전한 어댑터(Cat # 13519-13520 또는 이와 동등한 기타 제품) 또는 MGI® 사용을 위한 완전한 어댑터(Cat # 13360-13362 또는 이와 동등한 기타 제품).

7. 도서관 품질 검사

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / High Sensitivity Chip 또는 이와 동등한 제품, 라이브러리 정량화 시약.

8. 기타 자료

무수에탄올, 멸균 초순수, 저흡착 건헤드, PCR 튜브, 자기프레임, PCR 장비 등.

흐름도

그림 1: RNA 라이브러리 구축 프로세스

다양한 품질의 FFPE 샘플을 위한 RNA 라이브러리 준비

심하게 분해된 FFPE RNA(DV 200 <50%) 및 낮은 입력 샘플의 경우 라이브러리 손실을 줄이기 위해 어댑터 연결 후 이중 정제 프로토콜을 권장합니다.

다양한 품질의 FFPE 샘플의 피크 패턴