Hieff NGS ^TM DNA Library Prep Kit은 Illumina ® & MGI ® 시퀀싱 플랫폼을 위해 특별히 개발 및 설계된 차세대 라이브러리 구축 키트입니다 . 이전 세대 라이브러리 구축 키트를 기반으로 이 제품은 이전 버전보다 말단 복구, dA-테일링 및 어댑터 라이게이션에서 더 높은 효율성을 보여줍니다. 고충실도 효소는 증폭의 균일성과 충실도를 크게 향상시킵니다. 이 키트는 동물/식물/미생물의 표준 게놈 DNA, FFPE 샘플, cfDNA 및 ChIP DNA를 포함한 대부분의 DNA 샘플 유형과 호환됩니다.

명세서

구성 요소

저장

본 제품은 -25~-15℃에서 1 년간 보관하시기 바랍니다 .

노트

1. 운영에 관하여

1. 안전을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용하고 작업해 주시기 바랍니다.

2. 실온에서 성분을 해동합니다. 해동 후 , vortexing하여 완전히 섞고, 튜브를 잠깐 돌린 후 나중에 사용하기 위해 얼음 위에 두십시오.

3. 각 단계의 반응 용액을 제조할 때는 피펫을 사용하여 잘 섞거나 가볍게 흔드는 것이 좋습니다. 격렬하게 흔드는 경우 라이브러리 출력이 감소할 수 있습니다.

4. 교차 오염을 피하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 샘플을 처리할 때는 피펫 팁을 교체해야 합니다.

5. 부적절한 조작은 에어로졸 오염을 일으킬 가능성이 매우 높으며, 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. PCR 반응 혼합 영역과 PCR 생성물 정제 분석 영역의 의무적인 물리적 격리가 권장됩니다. 라이브러리 구축을 위한 특수 피펫과 같은 장비를 갖추고 있습니다. 0.5% 차아염소산나트륨 또는 10% 표백제로 표면을 닦아 각 영역에 대한 정기적인 청소를 수행합니다.

6. 본 제품은 연구용으로만 사용됩니다.

2. DNA 단편화

1. 이 키트는 기계적으로 단편화된 DNA 또는 효소적으로 단편화된 DNA와 모두 호환됩니다.

2. 이 키트는 100 pg - 1000 ng의 입력 DNA와 호환됩니다. A260/A280 = 1.8-2.0인 고품질 입력 DNA를 사용하는 것이 좋습니다. 표 1에는 권장되는 입력 DNA 양이 나와 있습니다.

표 1 입력 DNA의 권장량

참고사항 : 입력 DNA의 품질이 좋지 않거나 DNA 크기 선택이 필요한 경우, 입력 DNA 양을 이에 맞게 늘려야 합니다.

3. "입력 DNA"는 구체적으로 말단 수리/dA 테일링을 위해 준비된 DNA 샘플을 말합니다.

4. 입력 DNA 샘플에 금속 킬레이트제와 같은 고농도의 염이 포함되어 있는 경우 단편화 후 비드 정제/크기 선택 단계가 권장됩니다. 염은 말단 복구 및 dA 꼬리를 포함한 다음 반응의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 기계적 단편화 방법을 사용하는 경우 단편화를 위해 멸균된 초순수 대신 TE 완충액에서 DNA 샘플을 용출하십시오. 라이브러리 준비를 진행하기 전에 비드 클린업 또는 크기 선택을 수행하지 않고 효소적 단편화 방법을 사용하는 경우 사용된 정지 완충액에 금속 킬레이트제가 초과되지 않았는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 단편화된 샘플을 클린업하거나 크기 선택하여 라이브러리 준비를 진행하기 전에 TE 완충액이나 멸균된 초순수(≤50 μL)에서 용출하십시오.

3. 어댑터 결찰

1. Illumina 또는 MGI 긴 어댑터(바코드 어댑터) 키트와 짧은 어댑터 키트는 고객이 실험 요구 사항에 따라 선택할 수 있도록 제공됩니다 .

2. 고품질의 상용 어댑터를 선택하는 것이 좋습니다. 자체 제작 어댑터를 선택하는 경우 NGS 프라이머 합성 경험이 있는 회사에 맡기고 엄격한 오염 관리가 필요하다는 점을 언급하세요. 또한 교차 오염을 방지하기 위해 클린 벤치에서 DNA 어닐링 용액을 준비하고 매번 한 가지 유형의 어댑터만 작동하는 것이 좋습니다 .

3. 어댑터는 얼음 위나 4°C에서 해동하십시오. 실온에서 작동할 경우 어댑터가 변성되는 것을 방지하기 위해 실험실 온도는 25°C를 초과해서는 안 됩니다 .

4 . 어댑터의 품질과 농도는 라이게이션 효율과 라이브러리 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 어댑터 농도가 너무 높으면 어댑터 다이머 형성에 유리하고 어댑터가 너무 적으면 라이게이션 속도와 라이브러리 수율이 감소합니다. 어댑터를 사용할 때 입력 DNA 양에 따른 TE 버퍼로 희석한 해당 희석. 표 2-5는 이 키트를 사용하여 다양한 입력 DNA 양에 권장되는 어댑터 희석 방법을 나열합니다.

표 2 다양한 입력 DNA 에 대한 권장 Illumina ^TM 어댑터 양

표 3 다양한 입력 DNA 에 대한 권장 MGI ^TM 어댑터 양

표 4 권장되는 Illumina ^TM 다양한 입력 DNA 에 대한 UMI 어댑터 양

표 5 다양한 입력 DNA 에 권장되는 MGI ^TM UMI 어댑터 수량

4. 비드 기반 DNA 정화 및 크기 선택

1. DNA 크기 선택은 말단 수리/dA-테일링 전, 어댑터 연결 후 또는 증폭 후에 수행할 수 있습니다.

2. 입력 DNA 양이 50ng 이상인 경우 어댑터 라이게이션 직후에 크기 선택을 수행하는 것이 좋습니다 . 그렇지 않은 경우 증폭 후 크기 선택을 수행하세요.

3. 라이게이션 인핸서에는 PEG가 고농도로 포함되어 있어 정확한 크기 선택에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 어댑터 라이게이션 직후에 크기 선택을 수행해야 하는 경우 크기 선택 전에 비드 클린업 단계를 추가하는 것이 좋습니다. 크기 선택 단계는 엔드 리페어/dA-테일링 전이나 이후에 수행하면 직접 수행할 수 있습니다. 도서관 확대.

4. 자기 비드는 사용 전 실온에서 평형을 맞춰야 합니다. 그렇지 않으면 수율이 감소하고 크기 선택 효과에 영향을 미칩니다.

5. 자석 비드는 사용 전에 소용돌이 치거나 피펫으로 잘 섞어야 합니다.

6. 상층액을 옮길 때 비드를 흡입하지 마십시오. 미량의 비드라도 다음 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.

7. 80% 에탄올은 신선하게 제조해야 합니다. 그렇지 않으면 회수 효율에 영향을 미칩니다.

8. 정확한 크기 선택을 위해 100 μL 이상의 용량으로 시작하는 것이 좋습니다. 그보다 적으면 초순수로 용량을 100 μL까지 늘리는 것이 좋습니다.

9. 자석 비드는 제품을 용출하기 전에 실온에서 건조해야 합니다. 건조가 충분하지 않으면 에탄올 잔류물이 후속 반응에 영향을 미치기 쉽고, 건조가 너무 심하면 자석 비드가 갈라지고 정제 수율이 감소합니다. 일반적으로 실온에서 3~5분 동안 건조하면 비드가 완전히 건조되기에 충분합니다.

10. 필요한 경우, 0.1× TE 완충액 에서 용출된 정제 또는 크기 선택된 DNA 샘플은 4°C에서 1-2주 동안 또는 -20°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

5. 라이브러리 증폭

1. 라이브러리 증폭을 수행할지 여부는 DNA 입력량, 어댑터 유형, 시퀀싱 데이터 응용 프로그램 등에 따라 달라집니다. 부분 어댑터를 사용하는 경우 증폭 단계가 필요합니다. 전체 길이 어댑터를 사용하는 경우 입력 DNA가 200ng 미만이면 증폭을 수행하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 증폭이 필요하지 않습니다.

2. 증폭 사이클 수는 엄격하게 제어해야 합니다. 증폭이 충분하지 않으면 라이브러리 수율이 낮아질 수 있습니다. 과증폭은 편향, 오류, 중복된 판독 및 키메라 생성물을 증가시킬 수 있습니다. 표 6은 라이브러리 수율 1μg을 목표로 하는 권장 사이클 수를 나열합니다.

표 6 라이브러리 수율 1,000ng을 생성하기 위한 권장 사이클 수

메모 :

1. 표 6은 200bp 정도의 고품질 Input DNA 검사를 이용한 루프 매개변수의 수를 보여준다. FFPE DNA의 품질은 매우 다양하며, DNA 품질이 좋지 않거나 라이브러리 길이가 길 경우 충분한 라이브러리를 얻기 위해 사이클 수를 적절히 늘려야 한다.

2. 라이브러리 구축 과정 중에 크기 선택이 필요한 경우 라이브러리 증폭에 더 높은 사이클 번호를 권장합니다. 그렇지 않은 경우 더 낮은 사이클 번호를 권장합니다 .

3. 불완전한 어댑터를 사용하는 경우 완전한 어댑터를 형성하려면 최소 2사이클을 증폭해야 합니다.

6. 도서관 품질 분석

1. 구축된 라이브러리의 품질은 일반적으로 농도와 크기 분포를 측정하여 분석됩니다.

2. 라이브러리 의 농도는 Qubit, PicoGreen 또는 qPCR과 같은 형광 기반 방법을 통해 측정할 수 있습니다.

3. NanoDrop과 같은 흡광도 기반 정량화 방법을 사용하는 것은 권장되지 않습니다.

4. 라이브러리 정량화에는 qPCR 방법을 사용하는 것이 좋습니다. Qubit 및 PicoGreen과 같은 형광 기반 방법은 불완전한 dsDNA 구조(어댑터가 없거나 어댑터로 연결된 끝 중 하나만 있는 삽입물)와 완전한 라이브러리를 구별할 수 없습니다. qPCR 방법은 어댑터로 양쪽 끝이 연결된 완전한 라이브러리(시퀀싱 가능한 라이브러리)만 증폭하고 측정하므로 로딩을 위한 보다 정확한 측정을 제공합니다.

5. 라이브러리의 크기 분포는 모세관 전기영동이나 미세유체역학의 원리를 기반으로 하는 Agilent Bioanalyzer 또는 기타 장치를 사용하여 분석할 수 있습니다.

7. 기타 자료

1. DNA 정제 자기 비드: Hieff NGS ^TM DNA 선택 비드(Yeasen Cat#12601) 또는 AMPure ^® XP 비드(A63880) 또는 이와 동등한 다른 제품.

2. 어댑터: Illumina용 완전한 어댑터 : Yeasen Cat#13519-13520 ; 384 듀얼 CDI 프라이머 : Yeasen Cat#12412~Cat#12413 ; 384개의 고유한 이중 인덱스(UDI) 프라이머: Yeasen Cat#12 312 ~Cat#12 315 ; UMI UDI 어댑터 : Yeasen Cat#13370~Cat#13371 ; MGI용 완전한 어댑터: Yeasen Cat#13360-13362. DNA 프라이머 믹스: Cat# 12190 또는 Cat# 12191 .

3. 라이브러리 품질 분석: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip 또는 이와 동등한 제품, 라이브러리 정량 시약.

4. 기타 재료: 무수 에탄올, 멸균 초순수, 저유지 피펫 팁, PCR 튜브, 자기 스탠드, 열 순환기 등

지침

1단계. 수리/dA-Taling 종료

1. 표 7 에 언급된 시약을 녹입니다 . 뒤집어서 시약을 완전히 섞은 다음 나중에 사용하기 위해 얼음 위에 두십시오.

2. 얼음 위에서 표 7 에 따라 시약을 조립하세요 .

표 7 종료수리/dA-테일링 반응계

3. 피펫이나 흔들어 가볍게 섞은 후, 잠시 원심분리해서 용액을 가라앉힙니다.

4. 튜브를 열 순환기에 넣고 표 8에 따라 프로그램을 설정합니다.

표 8 종료 수리/dA-테일링 반응 프로그램

2단계. 어댑터 결찰

1. 표 2-5에 따라 어댑터를 적절한 농도로 희석하세요 .

2. 표 9 에 언급된 시약을 녹입니다 . 뒤집어서 시약을 완전히 섞은 다음 나중에 사용하기 위해 얼음 위에 두십시오.

3. 얼음 위에서 표 9 에 따라 시약을 조립하세요 .

표 9 어댑터 라이게이션 반응 시스템

참고 : *Ligation Enhancer는 점성이 있습니다. 뒤집거나 정점을 이루어 완전히 섞은 후 사용하기 전에 잠시 원심분리 하십시오 .

** Illumina ^TM 의 원래 농도 YEASE의 어댑터는 15 μM입니다. 어댑터를 입력량에 맞게 희석하여 어댑터 의 용량을 5 μL로 고정하십시오.

** MGI ^TM 의 원래 농도 YEASE의 어댑터는 1 0 μM입니다. 어댑터를 입력량에 맞게 희석하여 어댑터 의 용량을 5 μL로 고정하십시오.

4. 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 완전히 섞은 후, 잠시 회전을 줄여 튜브 옆면에서 액체를 모두 모으세요 .

5. 표 10 과 같이 예열된 열 순환기에서 샘플을 배양하고 어댑터 연결 반응을 수행합니다 .

표 10 어댑터 결찰 반응 프로그램

3단계. 어댑터 결찰 후 정리 또는 크기 선택

이 단계는 2 단계의 제품을 자기 비드로 정제하거나 크기를 선택하는 것입니다. 정제를 통해 잔류 어댑터, 어댑터 다이머 또는 기타 사용할 수 없는 제품을 제거할 수 있습니다.

어댑터-연결된 DNA 의 정리

1. 준비: Hieff NGS ^TM을 수강하세요 DNA 선택 비드를 냉장고에서 꺼내고, 최소 30분 동안 실온에서 평형을 유지합니다. 80% 에탄올을 신선하게 준비합니다.

2. 구슬을 뒤집어서 완전히 섞습니다.

3. 88을 더하다 어댑터-리게이션된 제품이 들어있는 튜브에 μL Hieff NGS ^TM DNA 선택 비드(0. 8 ×, 비드 : DNA = 0. 8 :1 )를 넣고 흔들어 잘 섞은 후 실온에서 5분간 배양합니다.

4. 용액을 내리기 위해 잠시 원심분리하고 원심분리 튜브를 자석 랙에 놓습니다. 자석 비드가 완전히 흡착되면(약 5분) 조심스럽게 액체를 제거합니다.

5. 튜브를 자석 스탠드에 두고, 갓 준비한 80% 에탄올 200 μL를 튜브에 직접 첨가합니다. 실온에서 30초 동안 배양하고 조심스럽게 액체를 제거합니다.

6. 반복 다시 5단계로 돌아가세요.

7. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고, 뚜껑을 열고 구슬이 깨질 때까지(5분 이내) 구슬을 말립니다.

8. 용출을 위해 튜브를 자석 스탠드에서 떼어냅니다. DNA를 용출하다

1). 제품의 크기를 선택할 필요가 없다면 ddH ₂ O 21 μL를 직접 첨가합니다. 10번 위아래로 흔들거나 피펫팅하여 완전히 섞습니다. 실온에서 5분간 배양합니다. 튜브를 잠깐 돌리고 자석 스탠드에 놓습니다. 용액이 투명해지면(약 5분) 자석 비드를 만지지 않고 상층액 20 μL를 조심스럽게 새 PCR 튜브로 옮깁니다.

2) 제품의 크기를 선택해야 하는 경우 102 μL ddH ₂ O를 직접 첨가합니다. 10회 위아래로 vortexing 또는 pipetting하여 완전히 섞습니다. 실온에서 5분간 배양합니다. 튜브를 잠깐 돌리고 자석 스탠드에 놓습니다. 용액이 투명해지면(약 5분) 자석 비드를 만지지 않고 상층액 100 μL를 조심스럽게 새 PCR 튜브로 옮깁니다.

참고사항 : 정제된 제품을 보관해야 하는 경우, TE 완충액으로 용출할 수 있습니다.

어댑터-연결 DNA의 크기 선택

1. 준비: Hieff NGS ^TM을 수강하세요 DNA 선택 비드를 냉장고에서 꺼내고, 최소 30분 동안 실온에서 평형을 유지합니다. 80% 에탄올을 신선하게 준비합니다.

2. 구슬을 뒤집어서 완전히 섞습니다.

3. 목표 크기에 따라, 표 11 에 따라 정제된 DNA 템플릿 100 μL에 첫 번째 라운드의 비드를 추가합니다 . 10회 vortexing 또는 pipetting하여 완전히 혼합합니다.

표 11 비드 기반 크기 선택을 위한 권장 비드:DNA 비율

참고 : 표의 "×"는 DNA 샘플의 양을 나타냅니다. 예를 들어, 라이브러리의 삽입 길이가 250bp이고 샘플 DNA 양이 100μL인 경우, 첫 번째 정렬 라운드에서 사용된 자기 비드의 양은 0.7×100μL=70μL이고 두 번째 정렬 라운드에서 사용된 자기 비드의 양은 0.20× 100μL=20μL입니다. 표의 권장 비드 양은 어댑터 라이게이션된 DNA에 대한 것입니다. 라이게이션 전에 크기 선택 절차를 수행하는 경우 Hieff NGS ^TM DNA 선택 비드(Cat#12601)의 제조 프로토콜을 참조하십시오.

4. 실온에서 5분간 배양합니다 .

5. 튜브를 잠깐 돌려서 자석 스탠드에 올려놓습니다. 용액이 투명해지면(약 5분) 상층액을 새 PCR 튜브로 옮깁니다.

6. 5단계의 샘플에 두 번째 라운드의 선택 비즈를 추가합니다. 표 11 에 따라 10회 이상 위아래로 흔들거나 피펫팅하여 완전히 섞습니다.

7. 실온에서 5분간 배양합니다 .

8. 용액을 내리기 위해 잠시 원심분리하고 원심분리 튜브를 자석 랙에 놓습니다. 자석 비드가 완전히 흡착되면(약 5분) 조심스럽게 액체를 제거합니다.

9. 튜브를 자석 스탠드에 두고, 갓 준비한 80% 에탄올 200 μL를 튜브에 직접 첨가합니다. 실온에서 30초 동안 배양하고 조심스럽게 액체를 제거합니다.

10. 반복하다 다시 9 단계 로 돌아가자.

11. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고, 뚜껑을 연 후 구슬이 완전히 깨질 때까지(5분 이내) 구슬을 말립니다.

12. 튜브를 자기 스탠드에서 꺼내 용출하고 , 21 μL ddH ₂ O를 직접 첨가합니다. 위아래로 볼텍싱 또는 피펫팅하여 완전히 섞은 후 실온에서 5분간 배양합니다. (참고: 정제된 제품을 보관해야 하는 경우 TE 완충액에서 용출합니다.) 튜브를 잠시 회전시키고 액체가 투명해질 때까지 자기 스탠드에 놓습니다(약 5분). 비드를 만지지 않고 20 μL 상층액을 새 PCR 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

4단계 라이브러리 증폭

이 단계에서는 PCR 증폭을 통해 정제된 제품이나 크기가 선택된 제품을 풍부하게 만들 수 있습니다.

1. 표 12 의 시약 목록을 녹이고 뒤집어서 완전히 섞은 후 나중에 사용하기 위해 얼음 에 두십시오.

2. 멸균된 PCR 튜브에 다음 반응을 조립하세요 .

표 12 어댑터-리게이션 DNA PCR 반응 시스템

[참고]: * 어댑터 전체를 사용한 경우 Hieff NGS ^TM Primer Mix (Yeasen Cat#1 2190 또는 Cat#12191 ) 이 필요합니다 . 불완전한 어댑터를 사용한 경우(Cat#12412~Cat#12413, Cat#12 312 ~Cat#12 315 , Cat#13370~Cat#13371), 키트 지침을 참조하고 키트에 제공된 인덱스 프라이머를 사용하여 증폭하십시오.

3. 피펫이나 흔들어 가볍게 섞은 후, 잠시 원심분리해서 용액을 가라앉힙니다.

4. 튜브를 열 순환기에 넣고 표 13 에 따라 프로그램을 설정하여 증폭을 시작합니다 .

표 13 PCR 증폭 반응 프로그램

5단계 증폭 후 정리/크기 선택

깨끗하다 위 단계는 다음을 참조합니다. 단계 3. Hieff NGS ^TM DNA 선택 비드(0.9×, 비드:DNA=0.9:1)는 PCR 생성물을 정제하는 데 사용됩니다. 크기 선택이 필요한 경우 단계 를 참조하십시오. 3 .

6단계 최종 라이브러리의 품질 관리

구축된 라이브러리의 품질은 일반적으로 농도와 크기 분포를 측정하여 평가합니다. 자세한 내용은 참고 6 을 참조하십시오 .