Hieff NGS™ OnePot Pro DNA 라이브러리 준비 키트 V4는 Illumina와 함께 사용하도록 설계된 차세대 효소 라이브러리 준비 키트입니다. 및 MGI 고처리량 시퀀싱 플랫폼. 이 키트는 기존 라이브러리 준비 방법과 비교하여 고품질 단편화 효소를 활용하여 번거로운 초음파 처리 프로세스가 필요 없습니다. 단편화 및 최종 복구 모듈이 단일 단계로 결합되어 라이브러리 준비 시간과 비용을 크게 줄입니다. 이 키트는 식물 및 동물 게놈, 미생물 게놈 등 광범위한 샘플 유형에 적합하며 샘플 입력 범위는 1ng~1μg입니다. 효소 단편화는 종 간 변이를 최소화하면서 다양한 종에서 균일한 단편 크기를 보장합니다. 또한 이 키트는 Illumina와 함께 사용할 수 있습니다. 또는 MGI Illumina 또는 MGI 고처리량 플랫폼에서 시퀀싱을 위한 어댑터 및 프라이머.

명세서

구성 요소

저장

본 제품은 -25~-15℃에서 1일간 보관하시기 바랍니다. 년도.

노트

1. 운영에 관하여

1. 안전을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑 을 착용하고 작업해 주시기 바랍니다.

2. 구성품을 실온에서 해동합니다. 해동 후 , vortexing하여 완전히 섞고, 튜브를 잠깐 돌린 후 나중에 사용하기 위해 얼음 위에 두십시오.

3. 각 단계의 반응 용액을 제조할 때는 피펫을 사용하여 잘 섞거나 가볍게 흔드는 것이 좋습니다. 격렬하게 흔드는 경우 라이브러리 출력이 감소할 수 있습니다.

4. 교차 오염을 피하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 샘플을 처리할 때는 피펫 팁을 교체해야 합니다.

5. 부적절한 조작은 에어로졸 오염을 일으킬 가능성이 매우 높으며, 결과의 정확도에 영향을 미칩니다. PCR 반응 혼합 영역과 PCR 생성물 정제 분석 영역의 의무적인 물리적 격리가 권장됩니다. 라이브러리 구축을 위한 특수 피펫과 같은 장비를 갖추고 있습니다. 0.5% 차아염소산나트륨 또는 10% 표백제로 표면을 닦아 각 영역에 대한 정기적인 청소를 수행합니다.

6. 본 제품은 연구용으로만 사용됩니다.

1. 이 키트는 100 pg - 1,000 ng의 입력 DNA 와 호환됩니다 . A260/A280 = 1.8-2.0인 고품질 입력 DNA를 사용하는 것이 좋습니다.

2. 금속 킬레이트제와 같은 고농도의 염이 입력 DNA에 도입되면 다음 실험에 영향을 미칠 수 있습니다. DNA 샘플을 ddH ₂ O 에서 용출하여 단편화하는 것이 좋습니다.

3. 표준 DNA 샘플의 단편화 시간은 표 6을 참조하십시오 . 이 키트는 단편화 편향이 낮고 다양한 GC 조성의 DNA 샘플에 대해 균일한 GC 적용 범위를 제공합니다. 실험 요구 사항에 따라 단편화 시간을 조정하십시오.

4. 정확한 분열을 위해 얼음 위에서 반응을 준비하세요.

3. 어댑터 결찰

1. 고객은 실험 요구 사항에 따라 Illumina 또는 MGI 긴 어댑터(바코드 어댑터) 키트와 짧은 어댑터 키트를 선택할 수 있습니다.

2. 고품질의 상용 어댑터를 선택하는 것이 좋습니다. 자체 제작 어댑터를 선택하는 경우 NGS 프라이머 합성 경험이 있는 회사에 맡기고 엄격한 오염 관리가 필요하다는 점을 언급하세요. 또한 교차 오염을 방지하기 위해 클린 벤치에서 DNA 어닐링 용액을 준비하고 매번 한 가지 유형의 어댑터만 작동하는 것이 좋습니다.

3. 어댑터는 얼음 위나 4°C에서 해동하세요. 실온에서 작동할 경우, 어댑터 변성을 방지하기 위해 실험실 온도는 25°C를 초과하지 않아야 합니다.

4. 어댑터의 품질과 농도는 라이게이션 효율과 라이브러리 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 어댑터 농도가 너무 높으면 어댑터 다이머 형성에 유리하고 어댑터가 너무 적으면 라이게이션 속도와 라이브러리 수율이 감소합니다. 어댑터를 사용할 때 입력 DNA 양에 따른 TE 버퍼로 희석한 해당 희석. 표 2-3은 이 키트를 사용하여 다양한 입력 DNA 양에 권장되는 어댑터 희석 방법을 나열합니다.

표 1 다양한 입력 DNA에 권장되는 Illumina 어댑터 양

표 2 다양한 입력 DNA에 권장되는 MGI 어댑터 양

4. 비드 기반 DNA 정화 및 크기 선택

1. DNA 단편 크기 선택 단계는 어댑터 결찰 후 또는 라이브러리 증폭 후에 수행할 수 있습니다.

2. 입력 DNA 양이 50ng 이상인 경우 어댑터 라이게이션 직후에 크기 선택을 수행하는 것이 좋습니다 . 그렇지 않은 경우 증폭 후 크기 선택을 수행하세요.

3. 라이게이션 인핸서는 PEG의 고농도를 함유하고 있어 정확한 크기 선택에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 어댑터 라이게이션 직후에 크기 선택을 수행해야 하는 경우 크기 선택 전에 비드 클린업 단계를 추가하는 것이 좋습니다. 크기 선택 단계는 엔드 리페어/dA-테일링 전이나 라이브러리 증폭 후에 수행하면 직접 수행할 수 있습니다.

4. 자기 비드는 사용 전 실온에서 평형을 맞춰야 합니다. 그렇지 않으면 수율이 감소하고 크기 선택 효과에 영향을 미칩니다.

5. 자석 비드는 사용 전에 소용돌이 치거나 피펫으로 잘 섞어야 합니다.

6. 상층액을 옮길 때 비드를 흡입하지 마십시오. 미량의 비드라도 다음 반응에 영향을 미칠 수 있습니다.

7. 80% 에탄올은 신선하게 제조해야 합니다. 그렇지 않으면 회수 효율에 영향을 미칩니다.

8. 정확한 크기 선택을 위해 100 μL 이상의 용량으로 시작하는 것이 좋습니다. 그보다 적으면 초순수로 용량을 100 μL까지 늘리는 것이 좋습니다.

9. 자석 비드는 제품을 용출하기 전에 실온에서 건조해야 합니다. 건조가 충분하지 않으면 에탄올 잔류물이 후속 반응에 영향을 미치기 쉽고, 건조가 너무 심하면 자석 비드가 갈라지고 정제 수율이 감소합니다. 일반적으로 실온에서 3~5분 동안 건조하면 비드가 완전히 건조되기에 충분합니다.

10. 필요한 경우, 0.1× TE 완충액 에서 용출된 정제 또는 크기 선택된 DNA 샘플은 4°C에서 1-2주 동안 또는 -20°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

5. 라이브러리 증폭

1. 라이브러리 증폭을 수행할지 여부는 DNA 입력량, 어댑터 유형, 시퀀싱 데이터 응용 프로그램 등에 따라 달라집니다. 부분 어댑터를 사용하는 경우 증폭 단계가 필요합니다. 전체 길이 어댑터를 사용하는 경우 입력 DNA가 200ng 미만이면 증폭을 수행하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 증폭이 필요하지 않습니다.

2. 증폭 사이클 수는 엄격하게 제어해야 합니다. 증폭이 충분하지 않으면 라이브러리 수율이 낮아질 수 있습니다. 과증폭은 편향, 오류, 중복된 판독 및 키메라 생성물을 증가시킬 수 있습니다. 표 3 라이브러리 수율 1μg을 목표로 권장되는 사이클 번호를 나열합니다.

표 3 라이브러리 수율 1,000ng을 생성하기 위한 권장 사이클 수

메모 :

1. 표 3은 200bp 정도의 고품질 Input DNA 검사를 이용하여 얻은 루프 매개변수의 수를 보여줍니다. FFPE DNA의 품질은 매우 다양하며, DNA 품질이 좋지 않거나 라이브러리 길이가 긴 경우 충분한 라이브러리를 얻기 위해 사이클 수를 적절히 늘려야 합니다.

2. 라이브러리 구축 과정 중에 크기 선택이 필요한 경우 라이브러리 증폭에 더 높은 사이클 번호를 권장합니다. 그렇지 않은 경우 더 낮은 사이클 번호를 권장합니다 .

3. 불완전한 어댑터를 사용하는 경우 완전한 어댑터를 형성하려면 최소 2사이클을 증폭해야 합니다.

6. 도서관 품질 분석

1. 구축된 라이브러리의 품질은 일반적으로 농도와 크기 분포를 측정하여 분석됩니다.

2. 라이브러리 농도는 Qubit, PicoGreen 또는 qPCR과 같은 형광 기반 방법을 통해 측정할 수 있습니다.

3. NanoDrop과 같은 흡광도 기반 정량화 방법을 사용하는 것은 권장되지 않습니다.

4. 라이브러리 정량화에는 qPCR 방법을 사용하는 것이 좋습니다. Qubit 및 PicoGreen과 같은 형광 기반 방법은 불완전한 dsDNA 구조(어댑터가 없거나 어댑터로 연결된 끝 중 하나만 있는 삽입물)와 완전한 라이브러리를 구별할 수 없습니다. qPCR 방법은 어댑터로 양쪽 끝이 연결된 완전한 라이브러리(시퀀싱 가능한 라이브러리)만 증폭하고 측정하므로 로딩을 위한 보다 정확한 측정을 제공합니다.

5. 라이브러리의 크기 분포는 모세관 전기영동이나 미세유체역학의 원리를 기반으로 하는 Agilent Bioanalyzer 또는 기타 장치를 사용하여 분석할 수 있습니다.

7. 기타 자료

1. DNA 정제 자석 비드: Hieff NGS ^TM DNA 선택 비즈(Yeasen Cat#12601) 또는 AMPure ^® XP 비즈(A63880) 또는 이와 동등한 제품. 

2. 어댑터: Illumina용 전체 어댑터 : Yeasen Cat#13519-13520 ; 384 듀얼 CDI 프라이머 : Yeasen Cat#12412~Cat#12413 ; 384 유니크 듀얼 인덱스(UDI) 프라이머: Yeasen Cat#1 2327 ~Cat#1 3330 ; UMI UDI 어댑터 : Yeasen Cat#13370~Cat#13371 ; MGI용 전체 어댑터: Yeasen Cat#13360-13362. DNA 프라이머 믹스 : Cat# 12190 또는 Cat# 12191.

3. 라이브러리 품질 분석: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip 또는 이와 동등한 제품, 라이브러리 정량 시약.

4. 기타 재료: 무수 에탄올, 멸균 초순수, 저유지 피펫 팁, PCR 튜브, 자기 스탠드, 열 순환기 등

8. 작업 흐름

그림 1. OnePot Pro DNA Library Prep Kit 의 워크플로