Taq DNA 중합효소의 비특이적 증폭은 PCR 실험에서 흔히 발생하는 문제로, 검출 결과 해석에 직접적인 영향을 미치고 증폭 감도의 감소, 심지어 표적 단편의 수율 감소로 이어질 수 있습니다. 효소 개질제를 사용하여 실온에서 Taq DNA 중합효소의 활성 중심을 봉인하여 실온에서 Taq 효소의 DNA 중합효소 활성을 억제하는 것이 현재 비특이적 증폭을 억제하는 가장 효과적인 방법입니다. Yisheng이 개발한 이중 봉인 항체는 Taq DNA 중합효소의 중합효소 활성을 봉인할 뿐만 아니라 Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성도 동시에 봉인합니다. 이 이중 접근 방식은 잘못된 페어링이나 프라이머 다이머로 인한 비특이적 증폭을 효과적으로 방지하고 물질 분해로 인한 비특이적 신호 생성을 방지하여 시약의 특이성을 두 배로 향상시킵니다. 이를 통해 검출 시약은 운송이나 실온에서도 쉽게 사용할 수 있습니다.

1. 매우 높은 증폭 특이성 - 이중 밀봉 항체는 중합효소와 엑소뉴클레아제 활동을 동시에 밀봉하여 비특이적 증폭을 효과적으로 피하고 특이성을 향상시킬 수 있습니다.

2. 뛰어난 검출 감도 - 핫스타트 제형은 낮은 농도의 유전자를 효과적으로 검출하여 더 높은 감도를 제공합니다.

3. 뛰어난 제품 안정성 - 37°C에서 5일 또는 4°C에서 10일 동안 보관 시 성능이 안정적입니다.

4. 기준선 안정성 및 우수한 선형성 - 기준선 드리프트 문제를 해결하여 우수한 선형성을 제공합니다.

5. 빠른 효소 활성 방출 - 95°C에서 20초 동안 가열하면 효소 활성의 95% 이상이 방출될 수 있습니다.

6. 효소의 광범위한 적용성 - 야생형과 돌연변이형 Taq 효소 모두에 적합하며 항체 1mg당 4-10KU의 Taq 효소를 봉입할 수 있습니다.

1 Taq DNA 중합효소 엑소뉴클레아제 활성 차단

합성 프라이머 프로브는 각각 Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물에 통합되었으며, 이는 봉인이 풀리거나 이중 폐쇄 항체로 봉인되었으며, 반응은 40°C에서 수행되었습니다. 두 가지 모두의 형광 신호가 검출되었으며, 이중 폐쇄 항체가 Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 효과적으로 봉인할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다.

그림 2. 이중 밀봉 항체-엔도뉴클레아제 활성의 밀봉 효율 검출.

02 검출감도 검증

각각 Yeasen사의 이중밀봉항체와 T사의 항체를 사용하여 Taq 효소를 밀봉한 후, ARMS-PCR 기술을 통해 양성 검체를 검출한 결과, Yeasen사의 이중밀봉항체로 밀봉한 Taq 효소가 ARMS-PCR 증폭에서 정확하고 민감도가 더 높은 것으로 나타났다.

빨간색: YEASEN 항체+Taq ; 파란색: 공급자 A 항체+Taq .

그림 3. ARMS-PCR의 증폭 곡선.

03 안정성 검증 (4℃에서 10일, 37℃에서 5일)

Taq DNA 중합효소를 각각 차단하기 위해 전통적인 폐쇄 항체와 이중 폐쇄 항체를 사용한 후, 중합효소는 프라이머와 프로브를 포함하는 완전한 프리믹스 용액으로 제형화됩니다. 이 용액은 4°C에서 10일 동안 또는 37°C에서 1, 3, 5일 동안 방치한 다음, ASF 플라스미드의 10,000개 사본을 증폭하는 데 사용됩니다. 증폭 곡선과 Ct 값에 유의미한 변화가 없는 것으로 관찰되었습니다.

그림 4. Taq 중합효소가 전통적인 차단 항체(A)와 이중 차단 항체(B)로 차단된 후 ASF 플라스미드 10,000개 사본의 증폭 곡선은 qPCR 시스템에 의해 증폭됩니다 . 

04 베이스라인 감지

특정 프라이머가 특정 버퍼 및 기기와 함께 사용되는 특정 조건에서는 베이스라인 드리프트라는 현상이 발생할 수 있습니다. 그러나 이중 폐쇄 항체를 사용하면 베이스라인 드리프트 문제를 효과적으로 해결할 수 있으므로 보다 안정적인 베이스라인을 용이하게 할 수 있습니다.

그림 5. qPCR 분석에서 SARS-CoV-2 N 유전자(A) 및 ACT 유전자(B)의 증폭 곡선.

05 선형성 검증

이중 폐쇄 항체로 밀봉된 반응 혼합물은 ASFV/ACT 이중 플라스미드의 100,000, 10,000, 1,000, 100개 사본을 증폭하여 표준 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 둘 다 좋은 선형성을 보입니다.

그림 6. 이중 블록 반응 혼합물을 사용하여 생성된 ASFV 유전자와 ACT 유전자에 대한 표준 곡선 그래프.

06 효소 활성 방출 검정

Yeasen의 이중 폐쇄 항체(Cat#31303)를 사용하여 Taq 효소를 밀봉하고 95°C에서 20초 동안 열 충격을 가한 후 효소 활성을 검출했습니다. 95°C에서 20초 동안 열 충격을 가한 후 31303은 효소 활성의 95% 이상을 방출할 수 있으며, 이는 Company T의 항체와 유사합니다.

표 1. 효소에 95°C에서 20초간 가한 열충격.

07 멀티플렉스 Taq 중합효소 검출

Yeasen의 이중 폐쇄 항체(Cat#31303)를 사용하여 3가지 유형의 Taq 중합효소(야생형 + 2가지 돌연변이형)를 1μg 대 5U의 밀봉 비율로 밀봉하고 형광 값과 밀봉 효율을 측정했습니다. 다양한 유형의 Taq 중합효소에 대해 Yeasen의 이중 폐쇄 항체(Cat#31303)가 우수한 밀봉 효과를 나타냄을 발견했습니다.

표 2. 다양한 유형의 Taq 중합효소의 차단된 효율성.