설명
Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt) 시약을 기반으로 한 빠르고 민감한 검출 키트입니다. WST-8은 MTT의 업그레이드 시약이며 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 수용성이 매우 좋은 주황색-노란색 포르마잔으로 환원될 수 있습니다. 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례합니다. 마이크로플레이트 리더로 검출된 450nm에서 포르마잔의 OD 값은 간접적으로 생존 가능한 세포의 수를 나타낼 수 있습니다. 이 키트는 약물 스크리닝, 세포 증식 및 세포 독성 검정, 종양 약물 감수성 검사 및 생물학적 요인의 활동 검출에 널리 사용됩니다.
CCK-8 방식의 장점
1. CCK-8 방법과 다른 세포 증식/독성 검출 방법의 비교.
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검출방법 |
MTT 방식 |
XTT 방식 |
WST - 1 방법 |
CCK 8 방식 |
|---|---|---|---|---|
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포르마잔 제품의 수용성 |
낮음(유기용매를 첨가하여 용해한 후 테스트해야 함) |
높은 |
높은 |
높은 |
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제품 특성 |
가루 |
용액 2병 |
해결책 |
1병의 용액 |
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사용방법 |
용액에 섞어서 사용하세요 |
이 용액은 사용 직전에 준비되었습니다. |
상자에서 꺼내기 |
상자에서 꺼내기 |
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검출 감도 |
높은 |
매우 높음 |
매우 높음 |
높은 |
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감지 시간 |
긴 |
짧은 |
짧은 |
가장 짧은 |
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검출파장 |
560~600nm |
420~480nm |
420~480nm |
430~490nm |
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세포독성 |
독성이 강하고 세포 형태가 완전히 사라짐 |
독성 낮음, 세포 형태 변화 없음 |
독성 낮음, 세포 형태 변화 없음 |
독성 낮음, 세포 형태 변화 없음 |
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시약 안정성 |
일반적인 |
낮은 |
일반적인 |
높은 |
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대량 샘플 테스트 |
실행할 수 있는 |
적절한 |
적절한 |
적절한 |
2. 페놀레드와 혈청은 CCK-8 검출을 방해하지 않습니다.
3. CCK-8 시약의 세포독성은 매우 낮으므로, CCK-8 시약을 첨가한 후 여러 차례 마이크로플레이트 리더로 반복적으로 판독하여 최적의 측정시간을 결정할 수 있습니다.
배송 및 보관
본 제품은 -25~-15ºC의 건조하고 어두운 곳에서 2년간 보관 가능합니다.
지침
1. 첫 번째 실험에서는 최적의 세포 도말 수와 CCK-8 시약의 최적 배양 시간을 결정하는 것이 좋습니다.
2. 가능하다면 다중 채널 피펫을 사용하여 복제 웰 간의 변동을 줄이십시오. 실험에서 거품이 생기지 않도록 하십시오. 거품은 OD 판독을 방해하기 때문입니다. CCK-8 시약을 첨가할 때는 배양 배지에 넣는 것보다 배양 플레이트의 벽에 가깝게 첨가하는 것이 좋습니다.
3. 백혈구는 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다.
4. 표준 96웰 플레이트를 사용하는 경우, 도말하는 세포 수는 최소 1,000개/웰(100 μL)입니다. 백혈구에 대한 검출 감도는 비교적 낮으므로 최소 2,500개/웰(100 μL)을 도말하는 것이 좋습니다. 24웰 또는 6웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 웰에 해당하는 세포 수를 계산하고 적절한 양의 CCK-8 시약을 첨가합니다(첨가하는 CCK-8 시약의 양은 플레이트의 각 웰에 있는 배양 배지 양의 10%입니다).
5. 450nm 필터를 사용할 수 없는 경우 흡광도가 430-490nm 사이인 필터를 사용할 수 있지만 450nm 필터는 가장 높은 검출 감도를 달성할 수 있습니다.
6. 페놀레드는 측정에 영향을 미치지 않습니다. 왜냐하면 페놀레드의 매질 내 흡광도는 공백 그룹의 흡광도를 빼면 제거될 수 있기 때문입니다.
7. 실험 진행 시에는 안전과 건강을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용해 주시기 바랍니다.
지침
I. 표준곡선을 만듭니다
1. 세포 현탁액을 준비하고 세포 밀도를 측정한 후 세포를 도금합니다.
2. 세포를 배양 배지로 일정한 비율(예: 1:2 비율)에 따라 순차적으로 희석하여 세포 농도 구배를 형성합니다. 일반적으로 3~5 세포 농도 구배, 각 농도에 대해 3~6 복제 웰.
3. 도말 후 세포를 2~4시간 배양하여 접착시킨다. 그런 다음 CCK-8 시약을 넣고 일정 시간 배양한 후 OD 값을 측정한다. X축을 세포 수, Y축을 OD 값으로 하여 표준 곡선을 그린다. 이 표준 곡선에 따라 미지의 샘플에서 세포 수를 결정할 수 있다(이 표준 곡선을 사용하는 전제는 실험 조건이 일관되어야 한다는 것이다).
II. 세포 생존력 검정
1. 96-well 플레이트에 세포(100 μL/well)를 넣습니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO 2 )에 넣어 사전 인큐베이션을 위한 시간 동안 둡니다.
2. 각 웰에 CCK-8 시약 10 μL를 첨가합니다(OD 판독을 방해할 수 있으므로 웰에 거품이 생기지 않도록 주의하세요).그리고 부드럽게 섞습니다.
3. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 1~4시간 동안 배양합니다.
4. 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정합니다.
5. OD 값이 즉시 측정되지 않으면 각 웰에 0.1 M HCl 용액 또는 1% w/v SDS 용액 10 μL를 넣고 플레이트를 덮은 후 실온에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다. 흡광도 값은 24시간 이내에 변경되지 않습니다.
III. 세포 증식 및 세포 독성 검정
1. 96-well 플레이트에 세포(100 μL/well)를 넣습니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO 2 )에 넣어 24시간 동안 사전 인큐베이션합니다.
2. 테스트할 물질의 농도를 다르게 하여 10 μL씩 플레이트에 첨가합니다.
3. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 일정 시간(예: 6시간, 12시간, 24시간 또는 48시간) 동안 배양합니다.
4. 각 웰에 CCK-8 시약 10 μL를 첨가합니다(OD 판독을 방해할 수 있으므로 웰에 거품이 생기지 않도록 주의합니다).그리고 부드럽게 섞습니다.
5. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 1~4시간 동안 배양합니다.
6. 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 흡광도를 측정합니다.
7. OD 값이 즉시 측정되지 않으면 각 웰에 0.1 M HCl 용액 또는 1% w/v SDS 용액 10 μL를 넣고 플레이트를 덮은 후 실온에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다. 흡광도 값은 24시간 이내에 변경되지 않습니다.
참고: 물질이 산화 또는 환원성인 경우, 물질의 효과를 제거하기 위해 CCK-8 시약을 첨가하기 전에 오래된 배양 배지를 새로운 배지로 교체합니다(오래된 배지를 제거하고, 세포를 새로운 배지로 두 번 씻은 다음, 새로운 배지를 추가합니다). 물질 자체가 흡광도 값에 약간의 효과만 있는 경우, 배양 배지를 교체할 필요가 없으며, 물질이 있는 공백 그룹의 흡광도 값을 빼면 물질의 효과를 제거할 수 있습니다.
계산식
세포생존율 = [(AC) /(BC)] x100%
저해율 = [(BA) /(BC)] x100%
A : 실험군의 흡광도 (세포가 들어있는 배양액과 CCK-8 시약, 시험물질의 흡광도)
B : 대조군의 흡광도 (세포가 들어있는 배양액, CCK-8 시약의 흡광도)
C : 블랭크군의 흡광도 (CCK-8 시약이 포함된 배양배지의 흡광도)
인용문
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