Annexin V-EGFP/PI 세포 사멸 검출 키트는 EGFP로 표지된 Annexin V를 프로브로 사용하여 초기 세포 사멸의 발생을 검출합니다.
검출 원리는 다음과 같습니다. 정상적인 살아있는 세포에서 포스파티딜세린(PS)은 세포막의 안쪽에 위치하지만, 초기 세포 사멸 세포에서 PS는 세포막 안쪽에서 세포막 표면으로 뒤집히고 세포 외 환경에 노출됩니다. Annexin-V는 분자량이 35~36kDa인 Ca ²⁺ 의존성 인지질 결합 단백질로 PS에 높은 친화력으로 결합합니다. 포스파티딜 세린은 세포 외부에 노출된 포스파티딜 세린을 통해 초기 세포 사멸 세포의 막에 결합할 수 있습니다.
또한, Propidium Iodide(PI)를 제공하여 생존하는 초기 세포와 괴사 또는 후기 세포사멸 세포를 구별합니다.PI는 핵산 염색약으로, 정상 세포나 초기 세포사멸 세포의 손상되지 않은 세포막은 통과할 수 없지만 후기 세포사멸 및 괴사 세포의 세포막은 통과하여 핵을 붉게 만들 수 있습니다.따라서 Annexin V를 PI와 결합했을 때 PI는 살아있는 세포(Annexin V ^- /PI ^- )와 초기 세포사멸 세포(Annexin V ⁺ /PI ^- )에서 배제되었습니다.후기 세포사멸 및 괴사 세포는 EGFP와 PI에 대해 모두 이중 양성 반응을 보였습니다(Annexin V ⁺ /PI ⁺ ).
이 키트는 유세포분석 및 형광현미경에 적합합니다.

제품 구성 요소

배송 및 보관

구성품은 얼음팩과 함께 배송되며 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 빛을 차단하고 1년 동안 반복적인 동결과 해동을 피하세요.
[주의사항]: 단기간 내에 반복해서 사용해야 할 경우 4℃에서 보관하고 반년 동안 빛을 차단하여 보관할 수 있습니다.

주의사항

1) 세포사멸은 빠른 과정이기 때문에 염색 후 1시간 이내에 샘플을 분석하는 것이 좋습니다.
2) 부착 세포의 경우 소화는 중요한 단계입니다. 소화 용액에 EDTA를 사용하지 마십시오. EDTA는 Annexin V와 PS의 결합에 영향을 미칠 수 있습니다.
3) Annexin V-FITC는 Annexin V-EGFP가 아닌 세포를 고정하는 데 사용해야 하며, 예를 들어 세포 사멸과 세포 주기를 동시에 감지하는 데 사용해야 합니다. EGFP는 고정 중에 변성되어 형광을 여기하는 능력을 잃기 때문입니다. 고정 전에 세포를 Annexin V-FITC와 함께 배양하고 결합되지 않은 Annexin V-FITC는 Binding Buffer로 씻어냈습니다. 고정 중에 세포 투과성이 증가하면 Annexin V에 결합하여 결과를 방해할 수 있는 세포 파편이 생성되기 때문입니다.
4) 샘플이 혈액에서 나온 경우, 혈액에서 혈소판을 제거해야 합니다. 혈소판에는 PS가 들어 있어 Annexin V에 결합하여 결과를 방해할 수 있기 때문입니다. 혈소판은 EDTA가 들어 있는 완충제를 사용하여 200g에서 원심분리하면 씻어낼 수 있습니다.
5) 덮개를 열기 전에 시약을 잠시 원심분리하고, 덮개 안쪽 벽면에 있는 액체를 튜브 바닥으로 쏟아서 덮개를 열 때 액체가 튀는 것을 방지하세요.
6) Annexin V-EGFP와 PI는 광에 민감한 물질이므로 작동 중에는 빛을 피하십시오.
7) 연구 목적으로만 사용하세요!

지침

실험 설계
빈 튜브: Annexin V-EGFP와 PI 염색 용액이 없는 음성 대조 세포를 전압 조절에 사용했습니다.
단일 염색 튜브: Annexin V-EGFP만 보충된 양성 대조 세포를 사용하여 보상을 조절했습니다.
검출 튜브: 세포는 Annexin V-EGFP와 PI 염색 용액으로 처리되었습니다. 실험 데이터는 공백 튜브와 단일 염색 튜브의 매개변수를 조정하여 얻었습니다.
1.1 샘플 염색
1) 현탁세포 : 4°C에서 5분간 300g로 원심분리하여 세포를 수집하였습니다.
부착 세포: EDTA 없이 트립신으로 소화한 후, 세포를 4°C에서 5분 동안 300g로 원심분리하여 수확했습니다. 거짓 양성 반응을 방지하기 위해 트립신 소화 시간이 너무 길어서는 안 됩니다.
2) 세포를 미리 냉각된 PBS로 300g로 두 번 세척한 후 4℃에서 5분간 원심분리했습니다.
3) 세포를 1×Binding Buffer로 현탁시키고 농도를 1~5 ×106/mL로 조절하였다.
4) 세포 현탁액 100 μL를 5 mL 유세포 분석기 튜브에 넣고, Annexin V-EGFP 5 μL를 첨가한 후 세포를 섞은 후, 빛 아래에서 실온에서 5분간 배양했습니다.
5) PI Solution 10 μl와 PBS 400 μl를 첨가하여 즉시 염색을 실시하였습니다.
[주의사항]: 유세포분석을 이용하여 세포사멸을 검출할 경우 PI는 시간에 따라 큰 영향을 받으며, 시간이 너무 길면 PI 염색이 증가하므로 유세포분석은 1시간 이내에 완료해야 합니다.
1.2 유세포 분석
EGFP의 최대 여기 파장은 488nm이고, 최대 방출 파장은 507nm였다. PI-DNA 복합체의 최대 여기 파장은 535nm이고, 최대 방출 파장은 615nm였다. CellQuest와 같은 소프트웨어를 분석에 사용했고, 2색 점 플롯을 그렸으며, EGFP는 가로축이고 PI는 세로축이다. 샘플당 10,000개의 이벤트를 수집한다. 전형적인 실험에서, 세포는 세 개의 하위 그룹으로 나눌 수 있는데, 살아있는 세포는 매우 낮은 강도의 배경 형광만 가지고, 초기 세포사멸 세포는 강한 녹색 형광만 가지고, 후기 세포사멸 세포는 녹색과 적색 형광 이중 염색을 가진다.