Annexin V-Alexa Fluor488/PI 세포사멸 검출 키트의 검출 원리는 다음과 같습니다. 정상적인 살아있는 세포에서 포스파티딜세린(PS)은 세포막의 안쪽에 위치하지만 초기 세포사멸 세포에서 PS는 세포막 안쪽에서 세포막 표면으로 뒤집히고 세포 외 환경에 노출됩니다. Annexin-V는 분자량이 35~36KD인 Ca ²⁺ 의존성 인지질 결합 단백질로 PS에 높은 친화력으로 결합하고 세포 외부에 노출된 포스파티딜세린을 통해 초기 세포사멸 세포의 세포막에 결합합니다.
또한, Propidium Iodide(PI)는 생존하는 초기 세포와 괴사 또는 후기 세포사멸 세포를 구별하기 위해 제공됩니다. PI는 핵산 염료로, 정상 세포 또는 초기 세포사멸 세포의 손상되지 않은 세포막은 통과할 수 없지만 후기 세포사멸 및 괴사 세포의 세포막은 통과하여 핵을 붉게 만들 수 있습니다. 따라서 Annexin V를 PI와 결합했을 때 PI는 살아있는 세포(Annexin V ^- /PI ^- )와 초기 세포사멸 세포(Annexin V ⁺ /PI ^- )에서 제외되었습니다. 반면, 후기 세포사멸 및 괴사 세포는 Alexa Fluor488 및 PI(Annexin V ⁺ /PI ⁺ )에 대해 이중 양성 반응을 보였습니다.

제품 구성 요소

배송 및 보관

구성품은 얼음팩과 함께 배송되며 -20°C에서 1년간 보관할 수 있습니다.

주의사항

1) 세포사멸은 빠른 과정이기 때문에 염색 후 1시간 이내에 샘플을 분석하는 것이 좋습니다.
2) 부착 세포의 경우 소화는 중요한 단계입니다. 소화 용액에 EDTA를 사용하지 마십시오. EDTA는 Annexin V와 PS의 결합에 영향을 미칠 수 있습니다.
3) 샘플이 혈액에서 나온 경우, 혈액에서 혈소판을 제거해야 합니다. 혈소판에는 PS가 들어 있어 Annexin V에 결합하여 결과를 방해할 수 있기 때문입니다. EDTA가 들어 있는 완충제를 사용하고 200g에서 원심분리하여 혈소판을 씻어낼 수 있습니다.
4) 덮개를 열기 전에 시약을 잠시 원심분리하고, 덮개 안쪽 벽면에 있는 액체를 튜브 바닥으로 쏟아서 덮개를 열 때 액체가 튀는 것을 방지하세요.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 및 PI는 감광성 물질이므로 취급 시 빛에 닿지 않게 보관해야 합니다.
6) 연구 목적으로만 사용하세요!

지침

1.1 샘플 염색
1.a) 현탁 세포: 세포는 4°C에서 5분 동안 300g로 원심분리하여 수집했습니다.
b) 부착 세포: EDTA 없이 트립신으로 소화한 후, 세포를 4°C에서 5분 동안 300g로 원심분리하여 수확했습니다. 트립신 소화 시간은 거짓 양성을 방지하기 위해 너무 길어서는 안 됩니다.
2. 세포를 4°C로 예냉한 PBS로 두 번 세척하였고, 매번 300g를 사용하여 세척한 후, 4°C에서 5분 동안 원심분리하였습니다.
3. 세포를 250 μL 1×Binding Buffer를 첨가하여 현탁시키고 농도를 1×106/mL로 조정했습니다.
4. 세포 현탁액 100 μL를 5mL 유세포 분석기 튜브에 넣고, Annexin V-Alexa Fluor 488 5 μL와 PI 10 μL를 첨가한 후 가볍게 혼합했습니다.
5. 반응은 빛을 차단하고 실온에 15분간 두었습니다.
6. 1×Binding Buffer 400 μL를 첨가하여 혼합한 후, 1시간 이내에 유세포분석기를 통해 샘플을 검출하였다.
[참고]: 세포 세척 중 세포 손실을 방지하기 위해 작은 팁을 사용하여 유체를 흡입할 수 있습니다.
1.2 유세포 분석
Alexa Fluor488은 최대 여기 파장이 488nm이고 최대 방출 파장이 519nm입니다. PI-DNA 복합체의 최대 여기 파장은 535nm이고 최대 방출 파장은 615nm입니다. CellQuest 및 기타 소프트웨어를 사용하여 Alexa Fluor488을 가로축으로, PI를 세로축으로 하는 2색 점 플롯을 분석하고 그렸습니다. 샘플당 10,000개의 이벤트를 수집합니다.
1.3 형광현미경 분석
1) Annexin V-FITC/PI로 이중 염색한 세포 현탁액 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨리고 커버 슬립으로 세포를 덮습니다.
2) 2색 필터를 사용한 형광 현미경으로 관찰했습니다. Annexin V-FITC 형광 신호는 녹색이고 PI 형광 신호는 빨간색이었습니다.