세포가 세포사멸을 겪을 때, 그들은 핵소체 사이의 유전체 DNA를 절단하는 엔도뉴클레아제 효소를 활성화합니다. 세포사멸 중 DNA 추출 후 전기영동을 통해 180-200bp의 DNA 사다리가 검출되었습니다.
TUNEL(TdT 매개 dUTP Nick End Labeling) 세포사멸 검출 키트(Alexa Fluor 488)는 조직 세포의 후기 세포사멸 과정에서 핵 DNA 단편화를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 원리는 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)의 작용 하에 Alexa Fluor 488-12-DUTP가 게놈 DNA 절단 중에 노출된 3'-하이드록실(3'-OH) 말단에 통합된다는 것입니다. 따라서 형광 현미경 또는 유세포 분석으로 검출할 수 있습니다.
Alexa Fluor 488 염료는 더욱 안정적이며 신호가 더 강해 마커가 더 밝고 소화에 대한 저항성이 더 강합니다.
이 키트는 광범위한 응용 분야를 가지고 있으며, 동결 또는 파라핀 절편뿐만 아니라 배양된 부착 세포나 현탁 세포에서 세포 사멸을 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

제품 구성 요소

배송 및 보관

구성품은 얼음팩과 함께 배송되며 -20°C에서 1년간 보관할 수 있습니다.

주의사항

1. 세포 세척을 위한 PBS, 정제 밀봉을 위한 항형광 소광 용액, 고정을 위한 4% 파라포름알데히드를 직접 준비해야 합니다.

2. 연구 목적으로만 사용하세요!

지침

1. 샘플 준비
1.1 파라핀 포매 조직 절편
1.1.1.파라핀 조직 절편을 실온에서 5분 동안 크실렌에 담근 후, 파라핀을 완전히 제거하기 위해 한 번 더 반복했습니다.
1.1.2.절편을 실온에서 5분간 100% 에탄올에 담가둔 후 한 번 더 반복합니다.
1.1.3. 실온에서 시료를 90, 80, 70% 농도의 에탄올에 3분씩 담가두었습니다.
1.1.4. PBS로 절편을 부드럽게 헹군 후 여과지로 유리 슬라이드 위의 샘플 주위에 있는 과도한 액체를 조심스럽게 닦습니다. 이 경우 파라핀 펜이나 소수성 펜을 사용하여 샘플 주위에 샘플 분포의 윤곽을 그릴 수 있으며, 이는 하류 투과성 처리 및 균형 라벨링 작업에 편리합니다. 실험하는 동안 샘플을 건조시키지 마십시오. 처리된 샘플을 젖은 상자에 넣어 샘플을 젖은 상태로 유지합니다.
1.1.5.2 mg/mL Proteinase K 용액을 1:100의 비율로 PBS로 희석하여 최종 농도가 20 μg/mL이 되도록 했습니다.
1.1.6.100 μL의 Proteinase K 용액을 20 μg/mL 농도로 각 샘플에 첨가하여 샘플을 완전히 덮은 후 실온에서 20분 동안 배양했습니다.
[참고]: Proteinase K는 조직과 세포가 후속 단계에서 염색 시약에 투과성이 되도록 돕습니다. 배양 시간이 너무 길면 후속 세척 단계에서 조직 절편이 캐리어 플레이트에서 떨어질 위험이 높아지고, 배양 시간이 너무 짧으면 투과성 처리가 충분하지 않아 라벨링 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 더 나은 결과를 얻으려면 Proteinase K의 배양 시간을 최적화해야 할 수 있습니다.
1.1.7. PBS 용액으로 샘플을 2-3회 헹구고, 과도한 액체를 부드럽게 제거하고, 여과지로 슬라이드의 샘플 주위에 액체를 조심스럽게 닦습니다. 처리된 샘플은 샘플을 촉촉하게 유지하기 위해 젖은 상자에 넣습니다.
1.2 조직의 동결 절편
1.2.1. 동결 절편을 제거하고 실온으로 되돌립니다. 슬라이드를 4% 파라포름알데히드 용액(PBS에 용해)에 담그고 고정한 후 실온에서 30분간 배양합니다.
1.2.2. 과도한 액체를 조심스럽게 제거하고 여과지를 사용하여 유리 슬라이드 위의 샘플 주위에 있는 과도한 액체를 조심스럽게 닦아냅니다.
1.2.3. 슬라이드를 PBS 용액에 담그고, 실온에서 15분간 배양한 후, PBS로 총 2번 더 세척했습니다.
1.2.4. 과도한 액체를 부드럽게 제거하고 여과지로 유리 슬라이드를 조심스럽게 닦아 샘플 주변의 과도한 액체를 제거합니다. 이 경우 파라핀 펜이나 소수성 펜을 사용하여 샘플 주변의 샘플 분포 윤곽을 그릴 수 있으며, 이는 하류 투과성 처리 및 균형 라벨링 작업에 편리합니다. 실험하는 동안 샘플을 건조시키지 말고 처리된 샘플을 젖은 상자에 넣어 샘플을 젖은 상태로 유지합니다.
1.2.5. 2 mg/mL Proteinase K 용액을 1:100의 비율로 PBS로 희석하여 최종 농도가 20 μg/mL이 되도록 했습니다.
1.2.6. 20 μg/mL 농도의 Proteinase K 용액 100 μL를 각 샘플에 완전히 덮일 때까지 첨가한 후 실온에서 10분 동안 배양했습니다.
[참고]: Proteinase K는 후속 단계에서 조직과 세포가 염색 시약에 투과성이 있도록 돕습니다. 배양 시간이 너무 길면 후속 세척 단계에서 조직 절편이 캐리어 플레이트에서 떨어질 위험이 높아지고, 배양 시간이 너무 짧으면 투과성 처리가 충분하지 않아 라벨링 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 더 나은 결과를 얻지 못한 경우 Proteinase K의 배양 시간을 최적화해야 할 수 있습니다.
1.2.7. PBS 용액이 담긴 열린 비이커에서 샘플을 2~3번 헹굽니다.
[주의사항]: 세척 단계에서 샘플이 벗겨지는 것을 방지하기 위해 병을 씻지 말고 유리 슬라이드를 PBS 용액에 2~3회 담가 세척하는 것이 좋습니다.
1.2.8. 과도한 액체를 부드럽게 제거하고 여과지를 사용하여 슬라이드의 샘플 주위에 액체를 조심스럽게 닦습니다. 처리된 샘플은 샘플의 수분을 보존하기 위해 젖은 상자에 넣습니다.
1.3 셀 크롤 시트 준비
부착 세포는 Lab-Tek of Chamber Slides에서 배양되었습니다. 세포사멸 유도 처리 후 슬라이드를 PBS로 두 번 세척했습니다.
1.4 세포 도말표본 준비 (폴리리신 코팅 슬라이드를 예로 들어)
1.4.1. 세포를 약 2 × 107 cells /mL 농도로 PBS에 현탁시키고, 세포 현탁액 50-100 μL를 폴리리신 코팅 슬라이드에 흡입한 다음, 세포 현탁액을 깨끗한 슬라이드로 조심스럽게 펴 펼쳤습니다.
1.4.2. 세포를 고정하고 슬라이드를 PBS에 4% 신선하게 제조한 파라포름알데히드가 들어 있는 염색 탱크에 담그고 4°C에서 25분간 두었습니다.
1.4.3. 슬라이드를 세척하고 PBS에 담근 후 5분간 실온에 두었다. PBS로 다시 세척한다.
1.4.4. 과도한 액체를 부드럽게 제거하고 여과지로 유리 슬라이드를 조심스럽게 닦아 샘플 주변의 과도한 액체를 제거합니다. 이 경우 파라핀 펜이나 소수성 펜을 사용하여 샘플 주변의 샘플 분포를 윤곽을 그려 하류 투과성 처리 및 균형 라벨링 작업을 용이하게 할 수 있습니다. 실험하는 동안 샘플을 건조시키지 말고 처리된 샘플을 젖은 상자에 넣어 샘플을 젖은 상태로 유지합니다.
1.4.5. 2 mg/mL Proteinase K 용액을 1:100의 비율로 PBS로 희석하여 최종 농도가 20 μg/mL이 되도록 했습니다.
1.4.6. 20 μg/mL 농도의 Proteinase K 용액 100 μL를 각 샘플에 첨가하여 완전히 덮은 후 실온에서 5분 동안 배양했습니다(투과성 처리를 위해 PBS로 준비한 0.2% Triton X-100 용액에 담가 실온에서 5분 동안 배양할 수도 있습니다).
[참고]: Proteinase K는 후속 단계에서 조직과 세포가 염색 시약에 투과성이 있도록 돕습니다. 배양 시간이 너무 길면 후속 세척 단계에서 조직 절편이 캐리어 플레이트에서 떨어질 위험이 높아지고, 배양 시간이 너무 짧으면 투과성 처리가 충분하지 않아 라벨링 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 더 나은 결과를 얻지 못한 경우 Proteinase K의 배양 시간을 최적화해야 할 수 있습니다.
1.4.7. PBS로 샘플을 2~3회 헹구고, 과도한 액체를 부드럽게 제거하고, 여과지로 슬라이드의 샘플 주위에 액체를 조심스럽게 닦습니다. 처리된 샘플은 젖은 상자에 넣었습니다.
2. 양성 대조군의 DNase 처리 단계
샘플 침투 후, 세포는 DNase I로 처리되어 양성 대조 슬라이드를 준비합니다. 이 과정은 일반적으로 처리된 세포 대부분이 녹색 형광을 보이게 합니다.
[참고사항]: 고정화된 세포에 DNA 분해 효소 I을 처리하면 염색체 DNA가 파손되어 표지될 수 있는 DNA의 3'-말단이 많이 생성됩니다.
2.1. 10 × DNase I 완충액을 탈이온수로 1:10의 비율로 희석합니다(각 샘플에 200 µL 1× DNase I 완충액이 필요합니다. 즉, 희석에는 20 µL 10 × DNase I 완충액과 180 µL 탈이온수가 필요합니다). 투과성 샘플에 100 µL의 방울을 넣고 실온에서 5분간 배양합니다. 나머지 100 µL 1 × DNase I 완충액에 1 µL의 DNase I(1U/µL)을 넣어 최종 농도가 10 U/mL이 되도록 합니다.
2.2. 액체를 살짝 두드려 낸 다음, 10 U/mL DNase I이 함유된 완충액 100 μL를 첨가하고 실온에서 10분간 배양했습니다.
2.3. 슬라이드를 두드려 과도한 액체를 제거하고, 탈이온수가 담긴 염색 탱크에서 3~4회 슬라이드를 철저히 씻습니다.
[참고]: 양성 대조 슬라이드에는 별도의 염색 탱크를 사용해야 합니다. 그렇지 않으면 양성 대조 슬라이드에 잔류 DNase I이 남아 실험 슬라이드에 높은 배경이 나타날 수 있습니다.
3. 라벨링 및 감지
3.1. 평형 완충액(5 × 평형 완충액)을 탈이온수에 1:5의 비율로 희석합니다(각 샘플에 100μL 1 × 평형 완충액이 필요합니다).
3.2. 평형 완충액(1× 평형 완충액 100μL)을 각 샘플에 첨가하여 해당 영역을 완전히 평형화하고 실온에서 10~30분 동안 배양했습니다. 또는 슬라이드가 평형화되었는지 확인하기 위해 1× 평형 완충액이 있는 VAT에 슬라이드합니다. 세포를 균형 맞추는 동안 얼음 위에서 Alexa Fluor 488-12-DUTP 라벨링 믹스를 해동하고 표 1에 따라 모든 실험과 선택적 양성 대조 반응에 충분한 TdT 배양 완충액을 준비합니다. 면적이 5cm2 미만인 표준 반응의 경우 용량은 50μl이고, 50μl를 실험 및 양성 대조 반응의 수에 곱하여 필요한 TdT 배양 완충액의 총 용량을 결정합니다. 표면적이 더 큰 샘플의 경우 시약 용량을 비례적으로 늘릴 수 있습니다.

표 1 실험 및 선택적 양성 대조 반응을 위해 준비된 TdT 배양 완충액

[음성 대조 시스템] : TdT 효소가 없는 대조 배양 완충액을 제조하고 TdT 효소를 ddH2O로 대체하였다.
3.3. 평형화된 영역 주변의 흡수지로 100 μl 1× 평형 완충액의 대부분을 씻어낸 다음, 5 cm2 면적의 세포에 50 μl TdT 배양 완충액을 첨가했습니다. 세포가 마르지 않도록 합니다. 그 후, 슬라이드는 빛으로부터 보호해야 합니다.
3.4. 시약이 고르게 분포되도록 셀 위에 플라스틱 커버슬립을 덮고, 물에 적신 종이 타월을 젖은 상자 바닥에 놓습니다. 슬라이드를 젖은 상자에 넣고 37℃에서 60분간 배양합니다. 젖은 상자를 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호합니다.
[참고]: 플라스틱 커버 유리는 사용 전에 반으로 잘라낼 수 있습니다. 커버 유리의 가장자리를 접어서 쉽게 제거하고 조작할 수 있습니다.
3.5. 플라스틱 커버슬립을 제거하고, 절편을 실온에서 5분 동안 PBS 용액에 배양했습니다. 그런 다음 절편을 신선한 PBS로 두 번 세척했습니다.
3.6. 여과지를 사용하여 샘플 주위와 뒷면에 PBS 용액을 부드럽게 닦습니다.
[참고사항]: 배경을 줄이기 위해 슬라이드를 PBS로 한 번 세척한 후 0.1% Triton X-100과 5 mg/mL BSA가 포함된 PBS로 5분씩 3번 세척하면 반응하지 않은 유리 마커를 깨끗하고 투명하게 유지할 수 있습니다.
3.7. 샘플은 염색 탱크에서 염색하고, 슬라이드는 PI 용액(1 μg/mL, 새로 제조하여 PBS로 희석)이 들어 있는 염색 탱크에 어둠 속에서 담근 후 실온에 5분간 두었습니다. (선택 사항): 샘플은 염색 탱크에서 염색하고, 슬라이드는 DAPI 용액(2 μg/mL, 새로 제조하여 PBS로 희석)이 들어 있는 염색 탱크에 어둠 속에서 담근 후 실온에 5분간 두었습니다.
3.8. 샘플을 씻고 슬라이드를 탈이온수에 담그고 5분간 실온에 두십시오. 총 3번의 세척을 위해 두 번 반복하십시오.
3.9. 슬라이드에 있는 과도한 물을 말리고 샘플 영역에 100 μl PBS를 첨가하여 샘플을 촉촉하게 유지했습니다.
3.10. 샘플은 형광 현미경으로 즉시 분석되었고, 녹색 형광은 표준 형광 필터 장치로 520±20 nm에서 관찰되었습니다. PI의 빨간색 형광은 > 620 nm에서 관찰되었고, 파란색 DAPI는 460 nm에서 관찰되었습니다. 필요한 경우 슬라이드는 어둠 속에서 4 ° C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
[참고]: PI/DAPI는 세포사멸 세포와 비세포사멸 세포 모두를 빨간색/파란색으로 염색할 수 있으며, 세포사멸 핵에만 Alexa Fluor 488-12-DUTP가 통합되어 녹색 형광이 국소화되었습니다.
4. 현탁세포는 유세포분석법으로 검출하였다.
4.1. 3~5 × 106개의 세포를 4°C에서 원심분리(300 × g)하여 PBS로 두 번 세척하고, 4°C에서 300g로 10분간 원심분리한 후, 0.5 mL PBS에 현탁시켰습니다.
4.2. 세포를 고정시키고 PBS로 제조한 1% 파라포름알데히드 용액 5 mL을 첨가하여 얼음 위에 20분간 두었다.
4.3. 세포를 4°C에서 300×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 5mL PBS에 재부유시켰다. 세척을 한 번 반복하고 세포를 0.5mL PBS에 재부유시켰다.
4.4. 세포를 투과시키고 얼음으로 미리 냉각한 70% 에탄올 5 mL를 첨가하여 -20°C에서 4시간 동안 배양했습니다. 세포는 -20℃에서 70% 에탄올에 1주일 동안 보관할 수 있거나, PBS에 준비한 0.2% Triton X-100 용액으로 세포를 투과시키고 실온에서 5분간 보관할 수 있습니다.
4.5. 세포를 300×g에서 10분간 원심분리하고 5mL PBS에 재부유시켰다. 원심분리를 반복하고 1mL PBS에 재부유시켰다.
4.6. 2×106개의 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
4.7. 평형은 300×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하고 80 μL 1×평형 완충액으로 재부유시켰다. 실온에서 5분간 배양한다.
4.8. 세포를 균형 맞추는 동안 Alexa Fluor 488-12-DUTP Labeling Mix를 얼음 위에 녹이고 모든 반응에 충분한 TdT 배양 완충액을 표 1에 따라 준비했습니다. 2×106개 세포의 표준 반응의 경우, 부피는 50 μL이고, 50 μL에 반응 수를 곱한 것이 필요한 TdT 배양 완충액의 총 부피입니다.
4.9. 세포를 300×g에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거하고 침전물을 50μL TdT 배양 완충액에 현탁시키고 빛을 차단한 채 37℃에서 60분간 배양했습니다. 세포는 15분마다 마이크로피펫으로 부드럽게 현탁했습니다.
4.10. 20 mM EDTA 1 mL를 첨가하고 미세피펫으로 부드럽게 혼합하여 반응을 종결시켰습니다.
4.11. 300g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 침전물을 5 mg/mL BSA가 포함된 PBS로 준비한 0.1% Triton X-100 용액 1 mL에 재부유시켰다. 용액을 한 번 반복하고 총 두 번 세척했다.
4.12. 상층액을 300g에서 10분간 원심분리하여 제거하고, 세포를 PBS로 새로 제조한 5μg/mLPI 용액 0.5mL에 현탁시켰습니다. 이 용액에는 DNase-free RNase A가 250μg 포함되어 있습니다.
4.13. 세포는 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 배양되었습니다.
4.14. 세포는 유세포 분석기로 분석하였고, 녹색 형광은 520±20 nm에서 관찰되었다. PI의 적색 형광은 > 620 nm에서 관찰되었다. PI는 세포 사멸 세포와 비세포 사멸 세포 모두를 적색으로 염색할 수 있었고, 세포 사멸 핵에서만 Alexa Fluor 488-12-DUTP가 통합되고 녹색 형광이 국소화되었다.