지침

1. 실험 전 준비사항

1) 실험에 사용될 필요한 시약과 재료를 준비하세요.

2）qPCR 장비의 적합성 확인

이 키트는 아래와 같은 qPCR 장비 유형에 사용할 수 있습니다.

1. 바이오라드: CFX96
2. Thermo Scientific: 7500 실시간 PCR 시스템;QuantStudio™5;
3. 실험방법

1) DNA 추출

DNA 추출을 위해 'Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit' (수동 추출의 경우 Cat#18461ES, 자동 추출의 경우 Cat#18462ES)를 사용하는 것이 좋습니다. 자세한 내용은 'http:/www.yeasenbiotech.com'을 방문하세요.

자세한 정보와 구매.

키트(Cat#40619ES)에는 내부 대조군(IC)이 들어 있습니다. DNA 추출 전에 샘플에 IC를 추가하면 전체 프로세스(DNA 추출 및 qPCR 반응 포함)를 확인할 수 있습니다. qPCR 마스터 믹스에 IC를 추가하면

직접적으로 IC는 qPCR 제어로만 작용합니다.

2）qPCR Mix 제조

1. Positive control(PCS), No template control(NTC), Negative control solution(NCS) 및 Testsample(TS)을 포함한 샘플 양에 따라 반응 수를 계산합니다. 2개의 반응을 병렬로 준비합니다.

각 샘플은 일반적으로 다음과 같습니다.

* PCS：양성 대조 용액；NTC：템플릿 대조 없음；NCS：음성 대조 용액；TS：테스트 샘플. 수행할 필요가 없습니다.

PCS와 NTC에 대한 샘플 추출이 필요하지만 NCS와 TS도 필요합니다.

반응 웰(M1)=(1×NCS + N×TS) ×2

반응 웰(M2)=(1×PCS + 1×NTC) ×2

반응 웰(M3)=(1×PCS + 1×NTC+ N×TS) ×2

1. 실험 설계와 아래 표에 따라 필요한 양의 시약을 얼음 위에 미리 녹여 둡니다.
2. 반응 수에 따라 qPCR Mix의 양을 계산합니다. 키트가 제품 출시와 같은 GMP 활동에 사용될 경우, 준비에 대해 표 1과 2를 사용하는 것이 좋습니다. 키트가 연구에만 사용되고 평가 후 추출 전에 IC를 추가할 필요가 없는 경우, 표 3을 따릅니다.

준비. M1, M2, M3을 모두 준비할 필요는 없다는 점에 유의하세요.

표 1 M1용 qPCR 혼합 시스템

*표 1의 구성체계는 NCS, TS 모두 추출전에 IC를 추가하는 것을 전제로 하고 있으므로 반드시 그럴 필요는 없다.

qPCR Mix 제조 시 IC를 첨가하는 방법. 추출 전 IC 첨가 방법: 먼저 IC를 DNA 희석제로 20배 희석한 후 1μL를 첨가합니다.

추가 추출을 위해 각 100μL 테스트 샘플에 희석된 IC를 넣습니다.

**이 키트에는 ROX Reference Dye가 포함되어 있지 않습니다. 현재 사용 중인 Real Time PCR 증폭기에 ROX Reference Dye가 필요한 경우 50×ROX Reference Dye(Cat#10200ES)를 사용하는 것이 좋습니다. 이 경우 추가된 용량은 표 1에 표시된 대로 0.8μL입니다. 다른 것을 사용하는 경우

ROX 제품 브랜드의 경우 ROX 추가에 대한 지침을 참조하십시오. ROX 참조 염료가 필요하지 않은 경우 추가된 용량은 0 μL입니다.

표 2 M2용 qPCR 혼합 시스템

*표 2의 구성 시스템은 PCS와 NTC에 추출 전 IC를 첨가하지 않는다는 전제 하에 구성한 것으로, qPCR Mix 제조 시 IC를 첨가해야 한다. 추출 후 IC 첨가 방법: DNA 희석액으로 IC를 100배 희석한 후 희석된 IC 1μL를 첨가한다.

각 qPCR 혼합 시스템.

**이 키트에는 ROX Reference Dye가 포함되어 있지 않습니다. 현재 사용 중인 Real Time PCR 증폭기에 ROX Reference Dye가 필요한 경우 50×ROX Reference Dye(Cat#10200ES)를 사용하는 것이 좋습니다. 이 경우 추가된 용량은 표 1에 표시된 대로 0.8μL입니다. 다른 것을 사용하는 경우

ROX 제품 브랜드의 경우 ROX 추가에 대한 지침을 참조하십시오. ROX 참조 염료가 필요하지 않은 경우 추가된 용량은 0 μL입니다.

표 3 M3용 qPCR 혼합 시스템

*표 3의 구성 시스템은 추출 전에 샘플에 IC를 첨가하지 않는다는 전제에 기반을 두고 있으므로, qPCR Mix를 제조하는 동안 IC를 첨가해야 합니다. 추출 후 IC 첨가 방법: DNA 희석제로 IC를 100배 희석하여 각 qPCR Mix에 1μL 첨가

체계.

**이 키트에는 ROX Reference Dye가 포함되어 있지 않습니다. 현재 사용 중인 Real Time PCR 증폭기에 ROX Reference Dye가 필요한 경우 50×ROX Reference Dye(Cat#10200ES)를 사용하는 것이 좋습니다. 이 경우 추가된 용량은 표 1에 표시된 대로 0.8μL입니다. 다른 것을 사용하는 경우

ROX 제품 브랜드의 경우 ROX 추가에 대한 지침을 참조하십시오. ROX 참조 염료가 필요하지 않은 경우 추가된 용량은 0 μL입니다.

3）템플릿 추가

1. qPCR Mix를 충분히 흔들어 섞은 후 저속으로 원심분리하여 캡에서 잔류액을 수집합니다.

튜브 바닥까지.

1. 각 반응 튜브/웰에 20 μL qPCR 믹스를 추가합니다. 각 반응 튜브/웰에 해당 qPCR 믹스를 추가하는 데 유의하세요.

샘플 튜브를 추가하고 오류를 방지하세요.

1. qPCR Mix가 들어 있는 튜브/웰에 AddTemplates를 추가합니다. 템플릿 추가는 표 4를 참조하세요.

표 4 템플릿 추가

*DNA 추출을 위한 NCS 템플릿으로 DNA 희석 완충액(40619-E)을 사용하는 것이 좋습니다.

**각 튜브/웰의 총 반응 용량은 40 μL입니다.

***튜브 뚜껑이나 플레이트 필름을 덮습니다. 형광 신호 판독에 영향을 미치지 않도록 튜브 뚜껑이나 필름에 표시를 하지 않도록 주의하세요.

또는 스크레이퍼로 필름을 반복해서 문지릅니다.

****템플릿을 넣은 후 반응 튜브나 플레이트를 저속으로 잠시 원심분리합니다. 충분히 흔들고 섞은 후 원심분리를 반복합니다.

뚜껑이나 벽에서 바닥까지 액체를 모으기 위해 저속으로 작동하십시오. 작동 시 거품이 생기지 않도록 하십시오. 혼합물이 있으면 기준선에 영향을 미칩니다.

잘 섞이지 않기 때문에 이 단계는 좋은 실험 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.

4）qPCR 프로그램 설정

1. 프로그램 파일 설정

예시(7500 Real-Time PCR System 장비 및 Real-Time PCR Software v2.4):

기기 유형：7500(96 웰)

실험 유형: 정량-표준 곡선

화학：Taqman® 시약

램프 속도: 표준(달리기를 완료하는 데 약 2시간)

1. 대상 채널 설정

"플레이트 설정"의 "대상 및 샘플 정의"에서 대상 1 채널(FAM)을 만들고, 보고 형광 그룹으로 FAM을 선택하고, 소광 형광 그룹으로 MGB 또는 없음을 선택합니다. 대상 2 채널(VIC)을 만들고, 보고 형광 그룹을 VIC로, 소광 형광 그룹을 없음으로 선택합니다. "플레이트 설정"의 "대상 및 샘플 할당"에서 추가 ROX 염료를 추가하지 않으면 "없음"을 선택합니다. 추가 ROX를 추가하면

록스.

1. 표준 증폭 프로그램 설정

표 5 표준 증폭 프로그램 설정

1. 기준선 및 임계값 설정:

기준선 조정의 원칙: 일반적으로 자동 기준선을 사용합니다. 수동으로 조정해야 하는 경우 지수 성장 기간 전의 주기를 시작 주기로 선택하고 초기 형광 수집의 변동 구역을 피합니다. 가장 빠른 지수 증폭 샘플의 Ct보다 1-2주기 전인 주기를 선택합니다.

종착점.

임계값 조정의 원칙: 일반적으로 자동 임계값을 사용합니다. 수동으로 조정해야 하는 경우 임계값을 Negative 샘플 또는 기준 노이즈보다 높게 설정해야 하며 일반적으로 임계값을 늦게 설정합니다.

지수 증폭 단계에서는 각 터널에 대해 상대적으로 독립적이고 적절한 임계값이 필요합니다.

5) 결과 분석

1. PCS, NTC 및 NCS에 대한 결과 판단:

IC를 추가한 경우: 각 대조 샘플의 사양은 표 6에서 충족되어야 합니다.

표 6 PCS, NTC, NCS의 결과 판정

IC를 추가하지 않은 경우: 각 품질 관리 샘플은 표 6의 FAM 신호 열 사양을 충족해야 하며,

VIC 채널을 분석해야 합니다.

1. TS에 대한 결과 판정

전제 조건: TS 결과 분석 전에 PCS, NTC 및 NCS가 표 6의 사양을 통과했는지 여부를 판단해야 합니다. 통과한 경우 다음 단계로 진행할 수 있습니다. 통과하지 못한 경우 TS 결과는 신뢰할 수 없으며

그 이유를 조사할 필요가 있다.

IC를 추가한 경우: 표 7의 FAM과 VIC의 결과 정보에 따라 해당 결과 판단을 구하시오:

표 7: TS의 결과 판정 (IC 추가)

*VIC 신호에 대한 억제가 있는 경우, 억제인자를 제거하기 위한 치료가 필요하거나 검사를 다시 실시해야 합니다.

IC를 추가하지 않은 경우: 표 8의 FAM의 결과 정보에 따라 해당 결과 판정을 찾으며, VIC 신호를 분석할 필요는 없습니다.

표 8: TS의 결과 판정 (IC 미첨가)

노트

1. 이 키트를 사용하기 전에 이 설명서를 주의 깊게 읽어주세요. 실험은 샘플 취급, 반응 시스템 준비 및 샘플 추가를 포함하여 표준화된 방식으로 수행해야 합니다.

2. 가능하면 시료 첨가 작업과 시약 제조 작업은 얼음 위에서 진행하세요.
3. 사용하기 전에 각 시약을 흔들어 섞고 잘 섞으세요.

4. 안전을 위해 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용하고 작업해 주시기 바랍니다.
5. 이 제품은 연구 목적으로만 사용됩니다.